草莓FaPYL5基因的鑒定及功能分析

張建 黃蕓

(北京農學院植物科學技術學院/農業應用新技術北京市重點實驗室, 北京 102206)

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是由花托發育而來的肉質果實，具有獨特的口感和較高的經濟價值[1]。草莓果實在成熟過程中沒有明顯的呼吸峰和乙烯釋放峰，屬于非呼吸躍變型果實，其營養生長和生殖生長的周期相對較短，植株易于繁殖，所以草莓也作為一種重要的模式植物被用于研究非呼吸躍變型果實的發育和成熟機理[2-6]。果實的成熟是一個復雜且受到遺傳和生長發育等諸多因子調控的過程[7-9]，非呼吸躍變型果實的成熟已經被證實主要受植物激素脫落酸(Abscisic Acid, ABA)的調控[10,11]。

ABA信號傳遞開始于信號的感知，ABA受體是ABA信號通路中最上游的組分，能感知信號，觸發下游ABA響應過程。目前已有許多ABA受體被發現和鑒定。PYR/PYL/RACR(Pyrabactin Resistance/ Pyr1-Like/ Regulatory Components of ABA Receptor) 蛋白最早通過遺傳篩選和酵母雙雜交的方法在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中被證實為ABA受體。隨著進一步的研究，PYR/PYL/RACR家族成為ABA受體中最被認可的受體家族，并證明了其都含有START(STAR-RELATED LIPID-TRANSFER)特征，在細胞核和細胞質內均有分布，在ABA信號轉導中起到了重要的作用。

PYR/PYLs/RCARs在靜息狀態下以二聚體形式存在，當與ABA結合后則以單體形式參與下游反應并激活下游ABA響應基因，調控果實成熟[12,13]。本研究以草莓ABA受體FaPYL5為切入點，確定FaPYL5的編碼基因和蛋白序列，原核表達并純化FaPYL5蛋白，驗證其受體活性并進行亞細胞定位，最終確定其在草莓果實發育過程中重要的正調控作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養及處理

本試驗材料為栽培草莓品種“章姬”。種植于北京農學院東大地溫室。培養條件為相對濕度70%～90%、溫度17～26℃、光照14h、黑暗10h。在果實發育的5個時期進行采樣。小綠期(SG)、大綠期(LG)、白果期(WT)、始紅期(IR)和片紅期(PR)，每個時期各取10個大小一致的果實樣本去除瘦果種子后切成0.2～0.3cm的薄片液氮速凍，置于-80℃待用。

1.2 FaPYL5基因的確定及克隆

采用北京華越洋公司快速通用植物RNA提取試劑盒3.0提取草莓果實5個時期總RNA，用北京全式金公司的反轉錄試劑盒將其反轉為cDNA。根據FaPYL5的開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)設計引物(表1)，利用高保真酶HI-FI PCR Mix(金普萊，北京)進行PCR擴增。將擴增產物連接到pET-30a克隆載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞(擎科，北京)。隨機挑取單菌落進行PCR及質粒雙酶切鑒定，并將陽性質粒送至睿博興科(北京)進行測序分析。

表1 本研究中所用引物

1.3 FaPYL5蛋白質理化性質和進化樹分析

用Blast在NCBI中搜索其它物種中與草莓FaPYL5相似基因序列，利用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對分析，并用MEGA-5軟件基于鄰位相連法構建系統發育樹。用Compute pI/Mw工具預測FaPYL5蛋白等電點和分子質量(http://web.Expasy. org/compute_pi/)，ProParam預測其分子式及不穩定指數(http://web.expasy.org/protparam/)；用ProtScale分析蛋白疏水性(http://web.expasy.org/protscale/)；二級結構和三級結構則分別用SOPMA(http://pbil. ibcp.fr/htm/index.php)和SWISS(http://swissmodel.expasy.org/)進行預測；PSORT進行蛋白亞細胞定位預測(http://psort.hgc.jp/form.html)。

1.4 FaPYL5的亞細胞定位觀察

將FaPYL5構建到Super1300-GFP載體上，轉化DH5α感受態細胞，選陽性質粒送測，得到正確構建的Super1300-FaPYL5-GFP表達載體。將載體轉入農桿菌株GV3101，侵染煙草葉片，3d后用激光共聚焦(Leica，德國)觀察煙草葉表皮細胞。

1.5 FaPYL5的表達模式分析

以草莓5個時期果實總RNA分別反轉的cDNA為模板，使用Trans Start Top UreenqPCR Super Mix試劑盒(北京，全式金)在Light Cycler 96實時PCR系統上進行qPCR，試驗重復3次。利用SPSS12.0軟件進行統計分析。

1.6 FaPYL5的原核表達及免疫印跡分析

將FaPYL5構建到pET-30a載體上，轉化DH5α感受態細胞，選陽性質粒送測，得到正確構建的pET-30a-FaPYL5表達載體，將載體轉入DEBL21感受態細胞得到重組菌株，對其進行蛋白表達誘導，誘導條件為16℃，180rpm，12h，然后用Ni-NTA純化樹脂預裝柱(生工上海)進行純化；對純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測及Western-blot驗證。

1.7 FaPYL5蛋白與ABA互作的分析

用等溫滴定量熱法(ITC)檢測FaPYL5蛋白與ABA之間的結合反應。用Origin軟件對試驗結果進行分析。

1.8 FaPYL5的瞬時表達分析

分別構建FaPYL5的沉默和超表達Gateway載體，將載體轉入GV3101農桿菌株，侵染草莓果實，然后觀察草莓果實表型。

2 結果與分析

2.1 FaPYL5的克隆及序列分析

用草莓白果期(WT)提取的RNA反轉的cDNA為模板，PCR擴增得到一條約650bp的特異性條帶(圖1)，測序結果與FaPYL5大小657bp一致。

圖1 FaPYL5的PCR擴增

2.2 FaPYL5基因生物信息分析

FaPYL5蛋白包含218個氨基酸，理論分子量約為23.6kD，等電點為8.70，推測的分子式為C1015H1632N308O323S11，理論不穩定系數為47.04，屬于不穩定型蛋白；多肽鏈中疏水性氨基酸多于親水性氨基酸且分布均勻，推測草莓FaPYL5屬于疏水蛋白。對FaPYL5及17個同源序列進行比對，并用MEGA 5.0構建進化樹。結果(圖2)顯示：FaPYL5與二倍體草莓FvPYL4(XP_004302617.1)高度同源，阿月渾子PvPYL4-like(XP_031280279.1)同源性最低。

圖2 FaPYL5與其它物種中同源蛋白的系統進化樹分析

2.3 FaPYL5亞細胞定位觀察

利用激光共聚焦顯微鏡觀察用轉入Super1300-FaPYL5-GFP載體的農桿菌侵染的煙草葉片，發現FaPYL5定位于細胞質(圖3)。

圖3 FaPYL5的亞細胞定位

圖4 不同時期FaPYL5的表達量

2.4 FaPYL5在草莓中的表達模式

以小綠(SG)、大綠(LG)、白果(WT)、始紅(IR)、片紅(PR)5個時期的草莓cDNA為模板進行熒光定量PCR表達量分析，結果顯示FaPYL5的表達量在草莓成熟過程中呈現上升趨勢(圖4)。

2.5 FaPYL5原核表達分析

用IPTG誘導pET-30a-FaPYL5-His重組菌株進行蛋白表達然后純化，對純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測及Western-blot驗證，通過計算發現FaPYL5-His重組蛋白大小約為29.6kD，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western-blot的結果中，30kD處均有特異性條帶，其大小與ProtParam預測的FaPYL5蛋白大小一致，證明重組載體能正確表達。

圖5 FaPYL5蛋白純化與Western-blot驗證

2.6 ABA互作驗證

將純化的FaPYL5蛋白與S-(+)-ABA用ITC進行滴定反應，其中FaPYL5蛋白和ABA的結合為吸熱反應，隨時間增加吸收熱量慢慢變小，最后趨向于飽和。利用Origin 5.0軟件進行數據分析：FaPYL5蛋白和ABA的解離常數Kd約為61.8μM。

圖6 用ITC檢測FaPYL5與ABA結合活性

2.7 草莓果實瞬時轉基因處理

對未離體的草莓大綠時期(LG)果實進行農桿菌注射侵染以達到瞬時轉基因的效果。處理后7d，RNAi果實顯示出了嵌合體的表型，即處理部分的果實保持在大綠時期，此時OE果實處于全紅果階段，而對照果實處于片紅階段(圖7)。

圖7 草莓果實瞬時轉基因處理

3 討論與分析

草莓是在冬季上市的肉質漿果，具有很高的經濟價值。根據其成熟規律被鑒定為非呼吸躍變型果實，且果實成熟受到ABA的調控[14,15]。本研究中，通過原核表達和蛋白純化技術，在體外得到了具有活性的FaPYL5蛋白并進行了Western-blot驗證；通過對FaPYL5和ABA進行的熱等溫滴定試驗對其受體結合功能進行了鑒定，確定了本研究中表達純化得到的草莓FaPYL5蛋白為ABA受體；將處于大綠時期(LG)的草莓進行農桿菌介導的瞬時轉基因處理，在未離體的草莓果實中調低FaPYL5的表達量，結果顯示RNAi干擾后的果實表現出成熟延緩或無法成熟的特征，以上結果表明，FaPYL5編碼的蛋白FaPYL5是ABA受體且該基因的表達量與草莓果實的成熟呈正相關。本研究的結果證明ABA受體FaPYL5在草莓果實成熟中起到了顯著的正調控作用，為ABA正調控草莓果實成熟提供了基因和蛋白層面上的依據。為草莓果實成熟調控的研究提供了一些分子生物學的理論依據。