去氫紫堇堿對慢性炎性痛小鼠痛行為學及脊髓炎癥因子表達的影響

殷智宇 阮文晴 孫 龍 魏 盼 宋建鋼

上海中醫藥大學附屬曙光醫院麻醉科，上海 201203

炎性痛機制復雜，臨床治療棘手且治療效果欠佳[1]。研究表明，促炎和抗炎細胞因子失衡導致的脊髓神經炎癥是慢性痛發生發展的關鍵原因[2-3]。去氫紫堇堿（dehydrocorydaline，DHC）是中藥延胡索中的一種小檗堿單體，動物和細胞學實驗均證實，DHC 具有抗炎作用[4-5]。筆者前期研究發現，單次腹腔注射DHC 可在福爾馬林疼痛模型中發揮鎮痛作用[6]，但DHC 是否通過調控脊髓促炎和抗炎因子的表達緩解脊髓神經炎癥，治療慢性炎性痛尚不清楚。本研究以完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）誘導的慢性炎性痛小鼠模型為研究基礎，觀察DHC 是否可以調控脊髓促炎和抗炎細胞因子的表達，緩解小鼠的痛覺過敏。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30 只雄性ICR 小鼠，6～8 周，體重28～32 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2015-0001，合格證號：44002100206635。本研究經上海中醫藥大學附屬曙光醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

DHC（純度≥98%，徐州微科曼得生物有限公司，貨號：VIC449），CFA（美國Sigma 公司，貨號：F5881），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）一抗、白細胞介素（IL）-1β一抗、IL-6 一抗、IL-10 一抗（英國Abcam 公司，貨號分別為：ab6671、ab2105、ab6672、ab134742），動態足底觸覺儀、熱輻射刺激儀（意大利UgoBasile 公司，型號：Model 37450、30370）。

1.3 方法

1.3.1 分組與給藥 將小鼠按隨機數字表法分為三組，每組10 只，分別為Sham 組、CFA 組和CFA+DHC組。造模前測定小鼠基礎痛閾值。Sham 組小鼠足跖中部皮下注射25 μL 生理鹽水，CFA 組和CFA+DHC 組小鼠足跖中部皮下注射25 μL CFA 建模。小鼠于造模后1～7 d，CFA+DHC 組小鼠每天腹腔注射10 mg/kg DHC（劑量參考本研究前期已發表文章[6]），CFA 組小鼠腹腔注射溶媒（10% DMSO），給藥后30 min 進行痛行為學測定。

1.3.2 慢性炎性痛造模 小鼠俯臥位，使用微量注射器在小鼠右后足跖中部皮下注射25 μL CFA[7-8]。

1.3.3 機械痛閾值的測定 使用動態足底觸覺儀測量小鼠的機械縮足反射閾值（the paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。將小鼠放入儀器中，適應環境安靜后，使用金屬線垂直地壓向小鼠足底中央表面，壓力均勻增加，陽性反應為足退縮或后肢回縮，此時壓力值即為PWMT。重復測量3 次，取3 次平均值為PWMT[9]。

1.3.4 熱痛閾值的測定 使用熱輻射刺激儀測量小鼠的熱縮足反射潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。在小鼠適應環境后將光點照射于小鼠足底中部皮膚，陽性反應為下肢出現特征性的回縮或抬起，此時儀器自動切斷電源，并顯示時間，數值即為PWL。重復測量3 次，取3 次平均值即為PWL[10]。

1.3.5 Western blot 檢測小鼠脊髓促炎因子和抗炎因子的表達 造模7 d 后，取小鼠脊髓腰膨大，裂解組織后靜置30 min，離心速度12 000 r/min，離心半徑15 cm，時間20 min，收集上清液，按BCA 蛋白測定試劑盒（英國Abcam 公司，ab102536）說明確定樣本蛋白濃度，于SDS 聚丙烯胺凝膠上恒壓電泳，電轉至PVFD 膜上，加一抗TNF-α（1∶800）、IL-1β（1∶1000）、IL-6（1∶1000）、IL-10（1∶1000）和β-actin（1∶1000），4℃過夜，PBST 漂洗濾膜，加入二抗孵育2 h，使用ECL 系統檢測免疫復合物，Image J 軟件分析條帶的灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（），采用重復測量的方差分析或單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni 法。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 連續腹腔注射DHC 對慢性炎性痛小鼠PWMT 的影響

整體分析發現：組間比較、時間點比較及交互作用差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。提示各時間點、各組間的PWMT 均存在差異，且處理因素對PWMT的作用會隨著時間的變化而變化。進一步兩兩比較，組內比較：Sham 組造模前后PWMT 比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。造模后，CFA 組、CFA+DHC 組PWMT 較造模前降低，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。組間比較：造模前，三組PWMT 基礎值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；造模后1～7 d，與CFA 組比較，CFA+DHC 組PWMT 升高，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 連續腹腔注射DHC 對慢性炎性痛小鼠PWMT 的影響（g，）

表1 連續腹腔注射DHC 對慢性炎性痛小鼠PWMT 的影響（g，）

注：與本組造模前比較，aP ＜0.05；與Sham 組同時間點比較，bP ＜0.05；與CFA 組同時間點比較，cP ＜0.05。DHC：去氫紫堇堿；PWMT：機械縮足反射閾值；CFA：完全弗氏佐劑

2.2 連續腹腔注射DHC 對慢性炎性痛小鼠PWL 的影響

整體分析發現：組間比較、時間點比較及交互作用差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。提示各時間點、各組間的PWL 均存在差異，且處理因素對PWL 的作用會隨著時間的變化而變化。進一步兩兩比較，組內比較：Sham 組造模前后PWL 比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。造模后，CFA 組、CFA+DHC 組PWL 較造模前縮短，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。組間比較：造模前，三組PWL 基礎值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；造模后1～7 d，與CFA 組比較，CFA+DHC 組PWL 延長，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表2。

2.3 DHC 對慢性炎性痛小鼠脊髓促炎性細胞因子和抗炎細胞因子表達的影響

造模后，與CFA 組比較，CFA+DHC 組脊髓TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達均降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與CFA 組比較，CFA+DHC 組脊髓IL-10蛋白表達增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

表2 連續腹腔注射DHC 對CFA 慢性炎性痛小鼠PWL 的影響（s，）

表2 連續腹腔注射DHC 對CFA 慢性炎性痛小鼠PWL 的影響（s，）

注：與本組造模前比較，aP ＜0.05；與Sham 組同時間點比較，bP ＜0.05；與CFA 組同時間點比較，cP ＜0.05。DHC：去氫紫堇堿；PWL：熱縮足反射潛伏期；CFA：完全弗氏佐劑

3 討論

小鼠足底注射CFA 后可引起明顯且持續時間較長的炎性痛，是慢性炎性痛經典模型[11-12]。本研究中，小鼠右后足底皮下注射CFA 后1～7 d 均可觀察到顯著的痛覺過敏，表現為致炎足PWMT 明顯降低、PWL明顯縮短，提示造模成功。

DHC 是中藥延胡索中的一種活性堿成分[13-14]。分子藥理學研究發現，DHC 具有抗炎、抗腫瘤、心血管系統保護等多方面藥理作用[15～19]。筆者前期研究發現，單次腹腔注射DHC 可顯著緩解小鼠福爾馬林炎性痛[6]。但是連續使用DHC 對慢性炎性痛治療的效果，以往鮮見報道。本研究發現，連續腹腔注射7 d DHC，可顯著提高小鼠的PWMT 和PWL，證實了連續使用DHC治療慢性炎性痛的有效性。

圖1 DHC 對慢性炎性痛小鼠脊髓促炎性細胞因子和抗炎細胞因子蛋白表達的影響（n=10）

外周炎性損傷發生后，脊髓水平的炎性細胞因子表達隨著損傷時間發生變化，產生中樞敏化，導致慢性炎性痛[20-21]。脊髓神經免疫反應過程中，膠質細胞激活后，釋放多種細胞因子，包括促炎性細胞因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎細胞因子（如IL-10），當促炎因子和抗炎因子表達失衡，中樞神經系統免疫應答平衡被打破，則產生脊髓神經炎癥，導致慢性炎性痛的發生發展[22～26]。本實驗CFA 慢性炎性痛模型小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達顯著增高，IL-10表達顯著降低，與行為學痛閾值下降一致，DHC 治療7 d，可顯著降低CFA 小鼠脊髓促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表達，并增加抗炎細胞因子IL-10蛋白的表達，說明DHC 可通過調節抗炎和促炎性細胞因子的表達發揮鎮痛作用。但DHC 具體是通過何種途徑調節脊髓促炎和抗炎細胞因子的表達仍需進一步研究。

綜上所述，DHC 可緩解CFA 慢性炎性痛小鼠的疼痛，其機制可能與調節脊髓促炎和抗炎細胞因子的表達有關。