分化型甲狀腺癌術后循環腫瘤細胞檢測與刺激性甲狀腺球蛋白相關性的研究

張富強， 智建潮， 李德宇， 丁獻敏， 楊光， 楊輝*

（1 鄭州大學附屬腫瘤醫院／河南省腫瘤醫院 核醫學科， 河南 鄭州450003；2 河南省虞城縣人民醫院 腫瘤科， 河南 商丘476300）

近年來甲狀腺癌的發病率逐年上升， 根據2014 年美國監測、 流行病學及預后項目數據， 甲狀腺癌發病率為12.90／10萬， 甲狀腺癌的預后較好、 生存率高， 對于病灶局限于甲狀腺內的患者， 5 年生存率達99.90%， 但有遠處轉移的患者則明顯降低， 僅為54.70%［1－3］。 循環腫瘤細胞 （CTCs） 檢測能盡早發現微轉移， 有助于準確判斷甲狀腺癌預后、 指導個體化治療、預測復發及轉移。 本研究回顧性分析131 例甲狀腺癌患者的資料， 探討分化型甲狀腺癌術后循環腫瘤細胞檢測 （CTCs） 與刺激性甲狀腺球蛋白 （sTg） 二者之間的相關性， 現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2019 年1 月至2019 年12 月我院收治的131 例甲狀腺癌患者的臨床資料， 男49 例， 女82 例， 年齡9 ～81 歲， 平均 （45.95 ± 14.83） 歲。 所有患者均經手術病理確診為分化型甲狀腺癌， 其中乳頭狀癌121 例、 濾泡癌10 例。

1.2 研究方法①刺激性甲狀腺球蛋白 （sTg） 檢測： 所有患者住院前均停服優甲樂2 ～4 周， 血清TSH＞30 mIU／L。 住院后空腹狀態下抽取患者肘靜脈血5 mL， 離心15 min 分離血清， 采用電化學發光免疫分析法檢測血清sTg 水平。 按sTg 結果分為sTg＜2 ng／mL 組 （A 組）， 2 ng／mL≤sTg＜10 ng／mL 組 （B 組）、10 ng／mL≤sTg ＜50 ng／mL 組 （C 組）、 sTg≥50 ng／mL 組 （D組）。 ②分離富集CTCs： 由我院分子病理實驗室完成， 具體步驟［4］： 將每個受試者的5 mL 血液樣本收集到EDTA 抗凝管中，然后使用紅細胞裂解緩沖液裂解紅細胞， 并用直徑為8 μm 的孔校準膜過濾。 過濾后， 將剩余的細胞重懸于含有4%甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水中5 min， 轉移至濾管中， 并再次過濾。 抽氣閥設置為產生至少0.08 MPa 的真空壓力。 ③原位雜交分析： 該測定法在24 孔板中進行， 其上富集的細胞用蛋白酶處理， 然后與上皮生物標記物EpCAM 和CK8／18／19、 間質生物標志物Vimentin 和Twist、 白細胞生物標志物CD45 特異的捕獲探針雜交。 記錄循環腫瘤細胞個數， 結果≥5 個判讀為陽性結果。 ④病例隨訪： 對患者進行隨訪觀察， 每3 ～6 個月行連續動態觀察， 必要時行頸部淋巴結、 肺部結節穿刺活檢， 取得病理結果從而明確患者診斷。

1.3 觀察指標①CTCs 檢測陽性率。 ②不同sTg 濃度組的CTCs檢測陽性率。 ③CTCs 檢測結果和sTg 濃度之間的相關性。 ④繪制ROC 曲線， 確定臨界值并評估診斷效能。

1.4 統計學處理應用SPSS 24.0 統計軟件處理。 計量資料均行正態性分析及方差齊性檢驗， 符合正態分布的計量數據以±s 表示， 符合非正態分布的計量數據以中位數、 極大值和極小值表示。 雙偏態變量數據相關性分析采用Spearman 法分析；各種率比較采用四格表χ2檢驗。 以穿刺病理確診結果為標準將CTCs 檢測結果繪制ROC 曲線； P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTCs 檢測陽性率以及CTCs 檢測與sTg 濃度相關性131例患者共檢出2 400 個循環腫瘤細胞， 中位數10 個， 最小0 個，最大131 個。 按≥5 個為陽性結果， 陽性率73.3% （96／131）（典型病例見圖1）。 sTg 濃度中位數6.97 ng／mL （0.02 ～895.62）。Spearman 相關性分析結果顯示， CTCs 檢測結果和sTg 濃度雙變量之間呈顯著性正相關 （r ＝0.418， P ＜0.01）。

圖1 甲狀腺癌CTCs 檢測結果陽性典型圖像

2.2 各組間CTCs 檢測陽性率比較D 組的CTCs 陽性率顯著高于其他三組， B、 C 組顯著高于A 組 （P ＜0.05）， B、 C 組間無顯著性差異 （P ＞0.05）。 見表1。

表1 各組間的CTCs 檢測陽性率比較

2.3 ROC 曲線分析與臨界值確定及診斷效能評估以穿刺活檢及多種影像學確診結果為金標準， 將CTCs 檢測結果繪制ROC曲線 （圖2）， 以約登指數最大點對應的臨界值決定CTCs 檢測的臨界值為4.5 個CTCs 計數／5 mL。 CTCs 檢測的敏感度91.1%，特異性為78.0%， AUC 為0.907 （95%CI： 0.845 ～0.969）。

圖2 ROC 曲線分析CTCs 檢測結果的診斷效能

3 討論

近年來研究［5］表明， 甲狀腺癌患者TgAb 陰性狀態下低水平sTg 預示較低的復發率及較好的預后， 但是sTg 受到殘留甲狀腺等因素的影響， 其水平高低及動態變化與疾病的緩解、持續及復發密切相關。 國內一項大樣本回顧性研究［6］結果顯示sTg 特異度僅為67.3%。 丁獻敏等［7］檢測首次131I 治療前sTg 濃度以預測甲狀腺復發轉移， 結果顯示6 例假陰性， 患者有遠處轉移灶， 但是sTg 水平很低。 以上研究結果表明單純依靠sTg 和131I 全身顯像來預測分化型甲狀腺癌微轉移是遠遠不足的。 自從19 世紀Ashworth 首次在靜脈血中檢測到腫瘤細胞并提出微轉移的理論， 經過多位學者的研究［8－9］， CTCs 技術逐漸成為臨床熱點； 傳統的CellSearch 方法對DTC 敏感性較低，本研究使用分離富集和原位雜交 （iFISH） 技術， 大大提高了分化型甲狀腺癌循環腫瘤細胞的檢測效率及準確性。 盡管本研究表明sTg 偏高的甲狀癌患者外周血檢測到循環腫瘤細胞， 但是樣本量少， 未能系統化研究； 本研究對影像學難以發現的隱匿性轉移灶 （＜2 mm） 尋求一種有效的生物學指標用來檢測和評估甲狀腺癌早期轉移和復發， 可實現對甲狀腺癌的精準化治療。

綜上所述， CTCs 檢測結果與sTg 濃度呈顯著正相關， 外周血CTCs 檢測能準確預測分化型甲狀腺癌的早期轉移， 可為分化型甲狀腺癌分期、 預后及治療提供重要依據。