牙髓炎的發病機制和分子靶標研究

努爾比亞木·麥麥提依明 吳 龍 趙 今

新疆醫科大學第一附屬醫院牙體牙髓科，新疆烏魯木齊 830000

牙髓是一種特殊的結締組織[1]。牙髓也會產生炎癥反應[2]。牙髓炎是影響牙髓組織的最常見的病理性疾病[3-4]。目前針對牙髓炎的診斷和治療具有一定的阻礙[5]。細菌感染是引起牙髓炎的主要原因[6]。牙髓防御系統中可以決定牙髓炎癥的程度[7]。細胞因子和趨化因子積聚可能促進牙髓炎的進展[8-9]。目前對牙髓炎的分子失調機制仍然沒有達成共識。本文從GEO 數據庫的兩個基因表達譜中整合了牙髓炎與正常牙髓組織的差異表達基因。通過生物信息學的分析方法探究牙髓炎的關鍵失調基因和分子機制。

1 資料與方法

1.1 數據來源及分析

從GEO 數據庫（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov/GEO/）收集牙髓炎數據集GSE77459（2016 年2 月）和GSE9 2681（2017 年12 月）。使用“limma”R 包（version 3.40.6）進行差異分析。設定閾值P ＜0.05 和log2FC>1 獲得差異表達基因（DEGs）。從蛋白質相互作用數據庫（http：//string-db.org）（version 11.0）篩選只包含差異基因的數據，設置得分為>500。利用Cytoscape 3.5.1 軟件進行網絡分析，得到基因的連接度（degree）。

1.2 富集分析和基因集富集分析（GSEA）

使用“cluster Profiler”R 包（version 3.12.0）進行基因本體論（GO）分析。使用Cytoscape 3.5.1 分析京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路。通過Broad Institute（http：//software.broadinstitute.org/gsea/）進行GSEA，篩選KEGG 信號通路。

1.3 樣本收集

各收集3 例牙髓炎及健康的牙髓組織。所有的樣本均獲得了患者的知情同意并獲得了新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.4 實時定量PCR（qRT-PCR）

利用Trizol（Invitrogen）提取牙髓組織總RNA，并用PrimescriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa）逆轉錄cDNA。通過SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）進行qRT-PCR反應。引物見表1。使用2-ΔΔCT的方法分析數據。

表1 引物序列

1.5 Western blot（WB）

通過RIPA 裂解液提取牙髓組織總蛋白。采用凝膠電泳分離等量蛋白質并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h 后在4℃下孵育一抗過夜。沖洗后與二抗孵育2 h。通過化學發光試劑（Millipore）觀察膜上的免疫反應蛋白。β-actin 為內參蛋白。抗體均購自Abcam 公司。所有實驗至少重復3 次。主要抗體如下：PTPRC（Abcam）、CD86（Abcam）、CD44（Abcam）、ERK1/2（Abcam）、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204;Abcam）、β-actin（Abcam）。

1.6 統計學方法

使用R 3.6.1 進行數據分析，使用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。采用student t 檢驗比較兩組之間的差異。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牙髓炎組織中的差異表達基因

GSE77459 中牙髓炎和健康對照之間有1280 個DEGs（圖1A）。差異變化倍數最大的前10 個基因見表2。GSEA 結果顯示，牙髓炎組織中Toll 樣受體、MAPK、JAK-STAT 信號通路明顯升高（圖1B）。通過GSE92681 的DEGs 驗證到81 個基因（圖1C）。它們可能是牙髓炎潛在的失調因子。

表2 GSE77459 中差異變化倍數較大的前10 個基因

2.2 生物功能和通路

GO 功能富集分析共識別了201 個生物學進程（BP）（圖2A），42 個細胞成分（CC）（圖2B）和6 個分子功能（MF）（圖2C）。它們主要集中于T 細胞活化和ERK1/2 通路的正向調節、白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子產生的調控等生物過程。另外，獲得的11 個KEGG 信號通路則反映了牙髓炎的差異基因主要與免疫和炎癥反應相關（圖2D）。

2.3 PPI 網絡構建與樞紐基因鑒定

潛在失調基因的PPI 網絡中包括55 個基因（圖3A）。通過網絡的degree 鑒定了前3 個基因作為關鍵失調基因，包括PTPRC、CD86 和CD44。此外，它們在兩套數據中的表達方向一致（圖3B）。

2.4 關鍵基因及信號通路驗證

通過qRT-PCR 和WB 驗證了CD44 在牙髓炎組織中顯著表達上調（圖4A）。前文發現CD44 正向調控ERK1/2 通路。在牙髓炎中ERK1/2 通路被激活（圖4B）。因此，CD44 可能通過ERK1/2 途徑促進牙髓炎的疾病進程。

3 討論

牙髓對外部因素很敏感，如齲齒引起的微生物感染等刺激[10]。這些因素可能引發炎癥級聯，進而通過神經源性炎癥向疼痛方向發展[11]。因此，深入了解牙髓炎癥過程對發展牙科診斷治療是至關重要的。本研究對牙髓炎和對照的測序數據進行了系統分析，鑒定了在牙髓炎中具有重要作用的關鍵分子和信號通路。

差異變化倍數最大的兩個基因中，IGKV1-5 在牙髓炎組織中表達顯著上調。有研究顯示其在牙周炎組織中表達上調，是與炎癥和疼痛有關的分子[12-14]。顯著下調基因NR1D1 可以調控NLRP 3 炎癥小體的活性[15]，還與增強巨噬細胞的抗細菌特性有關[16]。有81 個基因在兩套數據中同時差異表達。本研究認為這些基因更有可能是牙髓炎過程中的失調基因。另一方面，從GSEA 和富集分析結果中發現，牙髓炎相關的失調基因主要參與免疫炎癥相關的生物功能和信號通路。在牙髓感染的情況下，趨化白細胞使溶酶體酶增加，從而造成組織損傷[17]。Toll 樣受體4（TLR 4）通路參與大鼠急性牙髓炎所致傷害性感覺[18]。此外，TLR 4 的刺激還會引發一系列信號級聯，誘導腫瘤壞死因子-α和IL-1 的釋放[19-21]。

圖1 牙髓炎組織的差異表達基因

牙髓炎相關失調基因的PPI 網絡分析發現，大部分基因具有相互作用關系，可能在牙髓炎過程中具有協同作用。在PPI 網絡中的核心因子中，qRT-PCR 結果驗證了CD44 的表達差異。CD44 是一種廣泛表達的黏附分子，已有研究報道其在牙髓炎組織中的表達顯著上調[22]。CD44 正向調控ERK1 和ERK2 級聯反應，對炎癥具有促進作用[23]。本研究識別了CD44 通過ERK級聯反應促進牙髓炎的進程。這一過程應進行深入研究，以了解其作為標志物和治療靶點的潛力和影響。

圖2 失調基因的富集結果

圖4 驗證關鍵失調基因