伊曲茶堿中間體雜質的分離與鑒定

王宜運, 呂曉芳, 徐豪杰, 孟子暉*, 李加榮, 徐志斌, 薛 敏

(1.北京理工大學化學與化工學院,北京 102488;2.山東新華制藥股份有限公司,山東 淄博 255086)

帕金森氏病(PD)是老年人的神經退行性疾病。該疾病主要導致運動障礙,如靜息性震顫、肌肉僵硬、運動遲緩和步態異常,以及非運動性癥狀,如肌張力低下、睡眠障礙、焦慮和抑郁[1,2]。PD影響世界各地的數百萬人。中國有超過250萬PD患者。研究表明,PD的發病率會隨著年齡的增長而顯著增加,到2030年,PD的患者數量可能會增加一倍[3,4]。目前,尚未發現可以逆轉或治愈PD的確切藥物和相應療法。因此,如何有效地延遲PD的進程是當前亟待解決的問題。PD的治療主要是臨床對癥治療為主,以康復治療為輔,其中藥物治療是主要治療手段[5,6]。左旋多巴(L-dopa)是控制PD的非常有效的代表性藥物,但長期大量服用左旋多巴常伴有藥物運動型并發癥劑末現象,導致PD癥狀加重或者惡化[7,8]。

由日本的Kyowa Hakko Kogyo公司研發的伊曲茶堿((E)-8-(3,4-二甲氧基苯乙烯基)-1,3-二乙基-7-甲基-3,7-二氫-1H-嘌呤-2,6-二酮,見圖1)是一種新型選擇性腺苷A2A受體拮抗劑,通過激活丘腦底核的γ-氨基丁酸(GABA)能通路,改善患者的運動癥狀[9]。

圖 1 伊曲茶堿的化學結構Fig.1 Chemical structure of istradefylline

伊曲茶堿于2013年3月在日本上市,作為左旋多巴/卡比多巴的輔助療法,能明顯縮短關期,延長開期,可顯著降低左旋多巴治療的劑末現象[10-13]。與其他抗PD藥物相比,伊曲茶堿具有較小的副作用,在克服多巴胺藥物的某些缺陷上具有顯著作用,因此在治療PD方面具有廣闊的前景[14]。

伊曲茶堿的上市在PD患者的藥物治療上又邁出了成功的一步,但在伊曲茶堿的合成過程中,發現其中還存在一些未知雜質,這些雜質的存在會對藥物活性帶來一定的影響,對安全性帶來一定的風險。因此鑒定和減少藥物中的雜質非常必要,可以保證藥物的有效性和安全性[15,16]。目前高效液相色譜(HPLC)是最常用的雜質檢測方法之一[17,18]。

在伊曲茶堿合成中,中間體A1(6-氨基-1,3-二乙基-2,4-(1H,3H)-嘧啶二酮)是其中一個關鍵中間體,由1,3-二乙基脲與氰基乙酸經縮合、環合反應制得[19](見圖2)。

圖 2 中間體A1合成路線Fig.2 Synthetic route of intermediate A1

圖 3 (E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺的結構Fig.3 Structure of (E)-N-ethyl-2-cyano-3-ethylamino-2-butene amide

在我們前期的研究中,中間體A1的一個雜質已經被鑒定出并進行了表征,如圖3所示,其結構被鑒定為(E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺,此為中間體A1的降解雜質[20]。在對合成過程中的關鍵參數進行研究和分析時,發現A1中還存在另外一個未知雜質。因此,我們繼續展開研究以確定其結構,并對其進行鑒定及表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀:配備SPD-10 Avp檢測器的LC-20AD系統(日本Shimadzu);制備型高效液相色譜儀:KNAUER-AZURA HPLC系統(德國Knauer);高分辨率質譜(HRMS):1200RRLC-6520 Accurate-Mass Q-TOF(美國安捷倫),其中ESI為正離子模式。核磁共振(NMR)分析儀:Bruker AⅧ 600 M(美國Bruker);單晶衍射儀:Bruker-apex2 X射線衍射儀(美國Bruker)。

伊曲茶堿中間體:山東新華制藥股份有限公司(中國淄博)生產;色譜級乙腈、二甲基亞砜(DMSO)購自德國Merck;水通過Milli-Q水凈化系統(美國Millipore)進行凈化。

1.2 樣品制備

稱取0.4 g中間體A1放入50 mL的燒杯中,依次加入8 mL水、8 mL乙腈,超聲溶解,然后通過0.45 μm有機膜過濾,得到測試樣品溶液。

1.3 HPLC條件

分析型HPLC Agilent Zorbax C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;流動相:乙腈(A)和水(B);流速:1.0 mL/min;梯度洗脫(tmin/A∶B)=t0/20∶80,t15/60∶40,t20～t50/90∶10;檢測波長:268 nm。

制備型HPLC Ceres B制備柱(250 mm×30 mm,7 μm);流動相:乙腈-水(30/70,v/v);流速:30 mL/min;檢測波長:268 nm。

1.4 核磁共振、質譜分析條件

NMR:將樣品(氫譜:1 mg;碳譜:10 mg)放入清潔干燥的樣品管中,加入1 mL DMSO溶解后將樣品管密封好。將樣品管插入轉子,調整樣品管的高度,樣品管插入深度與量筒的底部相平。將轉子按序列放入進樣器,設置樣品檢測參數,開始測試。測試完成后,對圖譜進行處理。

HRMS:將樣品(10 mg)加入25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,用0.22 μm的有機濾膜過濾,得到樣品,備用。設置參數,進樣,開始測試。測試完成后,對圖譜進行處理,分析檢測結果。

1.5 單晶X射線衍射條件

單晶制備:于50 mL單口瓶中加入1 g伊曲茶堿中間體A1、20 mL乙醇,攪拌加熱至回流,待完全溶解,關掉熱源,冷卻至室溫后,繼續攪拌析晶2 h。抽濾干燥得伊曲茶堿中間體A1晶體。

檢測條件:Mo-Kα輻射(λ=71.073 pm),296 K。

2 結果與討論

2.1 雜質分析

通過高效液相色譜對伊曲茶堿中間體A1進行有關物質分析,在保留時間6.82 min和20.22 min處有兩個較大的雜質峰(見圖4)。在前期的研究[20]中,保留時間20.22 min處的雜質已經被鑒定出并進行了表征,保留時間6.82 min處雜質需要進一步分離、鑒定。

2.2 制備型HPLC分離、制備雜質

在1.3節制備型HPLC色譜條件下分離中間體A1及相關物質。從圖5可以看出,中間體A1和雜質分離度較好，收集保留時間為5.80 min處的餾分(經薄層色譜及分析型HPLC分析確定為目標物),然后用二氯甲烷萃取,減壓濃縮,干燥,得到淡黃色物料。

圖 5 中間體A1相關物質的制備HPLC圖Fig.5 Preparative HPLC chromatogram of intermediate A1 and its relative substances

2.3 雜質的表征

從圖6可以看出,雜質的HRMS圖顯示了質子化分子[M-H]-在m/z253.19處,與中間體A1的質譜(m/z183.100 8)明顯不同。

圖 6 雜質的HRMS圖Fig.6 HRMS spectrum of the impurity

雜質的NMR光譜圖見圖7。

圖 7 雜質的(a)1H NMR譜和(b)13C NMR譜Fig.7 (a) 1H NMR spectrum and (b) 13C NMR spectrum of the impurity

圖 8 雜質的(a)HSQC和(b)HMBC NMR譜圖Fig.8 (a) Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) and (b) heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) NMR spectra of the impurity

雜質1H-NMR:1H-NMR (600 MHz,DMSO):δ1.01 (q,J=6.9 Hz,3H),1.02 (q,J=6.9 Hz,3H),1.07 (t,J=6.9 Hz,3H),3.04 (p,J=6.8 Hz,2H),3.74 (q,J=7.0 Hz,2H),3.94 (q,J=7.1 Hz,2H),5.85 (s,1H)。

雜質13C-NMR (150 MHz,DMSO):δ13.9,14.1,15.9,34.6,34.9,36.9,81.9,152.2,153.3,159.3,162.0。

基于上述表征,該雜質比中間產物A1多一個甲基和一個亞甲基,雜質的分子骨架具有11個碳,這與具有8個碳的A1的分子骨架不一致。因此,可以得出結論,雜質是中間產物A1的副產物。

為了進一步確定雜質的結構,使用異核單量子相干譜(HSQC)和異核多碳相關譜(HMBC)(見圖8)來表征氫和碳。根據HSQC,H(δ1.02)與H-5(δ3.74)相關,并且與C-6(δ13.9)相關,因此被確認為H-6。H(δ1.01)與H-10(δ3.04)相關,并且與C-11(δ15.9)相關,被確認為H-11。H(δ1.07)與H-7(δ3.94)相關,并且與C-8(δ14.1)相關,被確認為H-8。H(δ3.74)與H-6(δ1.02)相關,并且與C-5(δ34.9)相關,被確認為H-5。H(δ3.04)與H-11(δ1.01)相關,并且與C-10(δ34.6)相關,被確認為H-10。H(δ3.94)與H-8(δ1.07)相關,并且與C-7(δ36.9)相關,已確認為H-7。H(δ5.85)與C-3(δ81.9)相關,被確認為H-3。

根據化學位移和相應的氫光譜,雜質的結構包含3個伯碳、3個仲碳、1個叔碳和4個季碳。在HMBC光譜中,伯碳峰(δ15.9)與H-11(δ1.01)相關,而與H-10(δ3.04)遠程相關,因此是甲基C-11。C(δ14.1)與H-8(δ1.07)相關,而與H-7(d3.94)遠程相關,為甲基C-8。C(δ13.9)與H-6(δ1.02)相關,而與H-5(δ3.74)遠程相關,因此為甲基C-6。根據HMBC光譜,仲碳峰(δ36.9)與H-7(δ3.94)相關,而與H-8(δ1.07)遠程相關,因此被確認為亞甲基C-7。C(δ34.9)與H-5(δ3.74)相關,而與H-6(δ1.02)遠程相關,被確認為亞甲基C-5。C(δ34.6)與H-10(δ3.04)相關,而與H-11(δ1.01)遠程相關,為亞甲基C-10。叔碳峰(δ81.9)與H-3(δ5.85)相關,與HMBC光譜無關,已確認為C-3。季碳峰(δ162.0)與HMBC譜圖中H-7(δ3.94)遠程相關,確認為C-4。HMBC譜顯示C(δ159.3)與H-10(δ3.04)密切相關,確認為C-9。C(δ153.3)與H-7(δ3.94)和H-5(δ3.74)密切相關,確認為C-1。C(δ152.2)與H-5(δ3.74)遠程相關,被確認為C-2。綜上所述,推測該結構為1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲(見表1)。

表1 雜質的HSQC和HMBC核磁共振數據Table 1 HSQC and HMBC NMR data of the impurity

為了進一步驗證和確定物質的空間結構,用單晶X射線衍射對分離出的雜質進行了表征,表征結果見表2。通過數據分析及單晶衍射結構(見圖9)分析,進一步確定其結構為1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲。

表2 雜質的晶體數據Table 2 Crystal data for the impurity

圖 9 雜質的單晶X射線衍射結構Fig.9 Single crystal X-ray diffraction structure of the impurity

2.4 雜質的形成機理

在合成中間體A1時使用的原料是過量的,因此我們推斷雜質的形成機理可能如下:氰基乙酸與二乙基脲、乙酸酐進行縮合反應得到中間體A1的過程(見圖2)中,過量的二乙基脲繼續與A1發生酰胺化反應生成1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲,即生成了此雜質(見圖10)。此雜質為中間體A1副產物,與前期研究[20]中發現的中間體A1降解雜質(E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺形成機理雖然不同,但同樣都是在高溫條件下形成的。

圖 10 推測的雜質反應機理Fig.10 Speculated reaction mechanism of the impurity

3 結論

本研究采用制備型HPLC分離伊曲茶堿中間體A1中的雜質。通過HRMS、NMR、2D NMR和單晶X射線衍射分析,雜質結構確定為1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲。推測其反應機理為:由于在堿性條件下或高溫下合成中間體A1時過量的二乙基脲而產生了中間體A1的副產物。該雜質的結構可能會對伊曲茶堿的安全性和有效性產生影響。為了確保伊曲茶堿的質量,在生產過程中需要對該雜質的含量進行控制。

致謝 感謝遼寧雙士利制藥技術有限公司提供2D NMR服務。