HPLC法測定枳芩顆粒中黃酮類成分的含量

高紅寧 潘雨柔 殷 奕 毛春芹 陸兔林

1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210046；2.南京多康商貿有限公司，江蘇南京 210000

枳芩顆粒是由枳實、黃芩、大黃、生姜等六味藥材組成的醫院制劑，具有清熱瀉火、消積解毒的功效，常用于治療心脾胃脘有積熱，實邪壅滯腑氣不通所致疼痛、濕熱下利等癥。枳實為方中君藥，2015年版《中華人民共和國藥典》以測定辛弗林含量來控制枳實飲片質量[1]，國內外文獻多以測定其黃酮類成分（柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷）來控制飲片質量[2-8]。黃芩為方中臣藥，黃芩苷是其質量控制的主要藥效成分，已有報道對含黃芩制劑中橙皮苷、柚皮苷、黃芩苷和新橙皮苷一種或幾種成分進行含量測定[9-15]。本試驗建立了以高效液相色譜法同時測定枳芩顆粒中4種黃酮類成分含量的方法，為整體控制枳芩顆粒的質量提供可靠、科學的實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Agilent公司安捷倫1100 高效液相色譜儀，Chem Station 色譜工作站；昆山市超聲儀器有限公司超聲波清洗器；鞏義市英峪予華儀器廠水浴鍋；德國梅特勒公司AB104-L分析天平。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（批號：110722-201011）；橙皮苷對照品（批號：110722-201011）；新橙皮苷對照品（批號：111857-201102）；黃芩苷對照品（批號：110715-200514）；以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。枳芩顆粒樣品（實驗室自制，批號：180112、180118、180123）。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：漢邦Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～ 28 min，5% ～ 26% A；28～36 min，26% A；36～48 min，26%～40% A）；流速：1 ml/min；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷對照品適量，置5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。分別精密量取單個組分對照品溶液，加甲醇配成每1 ml分別含柚皮苷0.194 mg、橙皮苷0.110 mg、新橙皮苷0.129 mg、黃芩苷0.453 mg的混合對照品液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取枳芩顆粒適量，研細，精密稱取1.00 g，置具塞錐形瓶中，加入25 ml甲醇，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，再稱定質量，加甲醇補足損耗的質量，搖勻，過濾，取續濾液，過0.45 μm的濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液配制 按照枳芩顆粒處方比例分別稱取除枳實、黃芩以外的其余藥材，按照枳芩顆粒制備方法分別制成缺枳實、缺黃芩、同時缺枳實和黃芩的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的配制方法操作，制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取供試品溶液、陰性對照溶液和混合對照品儲備液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件，注入高效液相色譜儀中，色譜圖見圖1。結果為陰性對照溶液在指標成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的色譜峰位置上無吸收，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷分離良好，在各出峰處均無干擾，表明該方法的專屬性良好。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以對照品質量濃度和峰面積積分值進行線性回歸，求得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的線性回歸方程、相關系數和線性范圍，結果見表1。

表1 4種對照品的標準曲線、相關系數及線性范圍

2.5 精密度試驗

取上述對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷峰面積RSD分別為0.34%、0.12%、1.43%、0.98%，表明儀器精密度良好。

圖1 枳芩顆粒的HPLC色譜圖

2.6 穩定性試驗

取枳芩顆粒樣品（批號：180118）1份，按照“2.2.2”項下制備方法得到供試品溶液，按上述色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，結果橙皮苷、柚皮苷、黃芩苷和新橙皮苷的RSD分別為1.21%、1.72%、1.76%、1.98%，表明供試品溶液在24 h范圍內穩定。

2.7 重復性試驗

取枳芩顆粒樣品（批號：180118）6份，每份1.00 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備得到供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷平均含量（n= 6）分別為 5.7189、2.8744、3.4124、16.4962 mg/g，RSD 分別為1.50%、1.55%、1.62%、1.25%，表明該方法重現性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的枳芩顆粒樣品（批號：180118）9份，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入低、中、高3個質量濃度的混合對照品溶液（含柚皮苷2.8614 mg/mL、橙皮苷1.4561 mg/mL、新橙皮苷1.7028 mg/mL和黃芩苷8.2624 mg/mL）0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.89%、96.32%、97.49%和99.13%，RSD分別為1.89%、1.78%、2.20%和2.71%。

表2 加樣回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定

取不同批次的枳芩顆粒，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷含量，結果見表3。

3 討論

3.1 提取條件選擇

本試驗考察了水、95%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇等不同提取溶劑，結果以甲醇提取4種成分較完全；在選擇提取方法時，考察了回流和超聲兩種提取方法，發現這兩種方法提取效果接近，但超聲提取節約時間、操作簡便，故選擇超聲提取法；在選擇提取時間時，考察了30、40、50 min不同提取時間，確定30 min時4種成分已基本提取完全。

3.2 色譜條件選擇

通過200～400 nm全波長掃描，發現柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷都在280 nm附近有最大吸收，而黃酮類成分一般都在280 nm處進行檢測，故確定280 nm為檢測波長；在選擇流動相時，依次考察了乙腈-水、乙腈-磷酸水、甲醇-水，結果表明乙腈（A）-0.1%（B）磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，0～28 min，5%～26% A；28～36 min，26% A；36～48 min，26%～40% A；流速1 ml/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μl時柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷有較好的峰形，各峰間的分離度均大于1.5。故選擇乙腈-0.1%磷酸水為流動相梯度洗脫。

枳芩顆粒具有清熱瀉火、消積解毒的功效，是在臨床上應用較廣的醫院制劑。方中枳實為君藥，黃芩為臣藥，枳實中最主要的活性物質是橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷，黃芩中含量最高的活性成分是黃芩苷，故選擇君藥枳實、臣藥黃芩中的主要成分作為枳芩顆粒的定量檢測指標。這4種成分均是黃酮類成分，在 280 nm 附近有最大吸收，在同一色譜條件下能很好地分離。本研究同時測定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷可為評價枳芩顆粒中活性成分提供一種可靠的分析方法，同時對于整體控制枳芩顆粒的質量提供理論依據。

本研究建立了HPLC法測定枳芩顆粒中黃酮類成分的含量方法，確定以甲醇為提取液，超聲提取30 min ，色譜柱為 Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水（梯度洗脫），流速1 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷分別在0.194～3.876、0.110 ～ 2.192、0.129 ～ 2.574、0.453 ～ 9.050 μg/ml時與色譜峰面積線性關系良好，平均回收率在96.32%～99.89%之間，分離效果好、操作簡便、重現性好、靈敏度高。

表3 枳芩顆粒中4種成分的含量