卵巢癌早期檢測的DNA甲基化標(biāo)志物研究進(jìn)展

孔令紅，萬智毅，劉曉剛

清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院病理科，北京 100022

卵巢癌的發(fā)病率在全部婦科惡性腫瘤中居第三位，但致死率最高。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國每年有5.21萬人被診斷為卵巢癌，2.25萬人死于卵巢癌。卵巢癌具有很高的異質(zhì)性，約90%屬于上皮性卵巢癌，其中約70%為漿液性，預(yù)后較差。早期（Ⅰ期）卵巢癌患者的5年生存率超過90%，然而早期卵巢癌無明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者很難在早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，70%以上的卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，5年生存率不足70%。卵巢癌異質(zhì)性強(qiáng)、進(jìn)展較快、缺乏合適的早期檢測方法是卵巢癌早期檢測的重要挑戰(zhàn)。因此，尋找可靠的卵巢癌早期檢測標(biāo)志物具有十分重要的意義。目前，血清糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是臨床中使用最廣泛的上皮性卵巢癌診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測的標(biāo)志物。但在早期卵巢癌患者中，其靈敏度不到50%，且特異度不高。很多疾病患者的血清中CA125水平都會升高，如子宮內(nèi)膜異位、腹膜炎、盆腔炎、子宮肌瘤、肝硬化等，在肺癌與結(jié)直腸癌中CA125的表達(dá)水平也會升高。因此，單獨(dú)檢測CA125并不適合用于上皮性卵巢癌的早期診斷。美國一項(xiàng)隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)[前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌（Prostate,Lung,Colorectal and Ovarian，PLCO）篩查試驗(yàn)]結(jié)果表明，與常規(guī)護(hù)理組（不接受CA125與陰道超聲年度篩查但進(jìn)行常規(guī)的醫(yī)療護(hù)理）相比，結(jié)合陰道超聲和CA125進(jìn)行卵巢癌篩查并不能降低卵巢癌的致死率。英國的卵巢癌篩查試驗(yàn)應(yīng)用陰道超聲與CA125篩查了20萬無癥狀的絕經(jīng)后女性，發(fā)現(xiàn)CA125結(jié)合陰道超聲檢測盡管提高了特異度（99.8%），但是并未顯著提高靈敏度。類似于PLCO研究，該研究的隨訪數(shù)據(jù)表明陰道超聲結(jié)合CA125檢測并未顯著降低卵巢癌的致死率。一些研究應(yīng)用CA125聯(lián)合其他血清腫瘤標(biāo)志物診斷卵巢癌，雖然提高了靈敏度與特異度，但仍不能滿足卵巢癌篩查的需求。其中非常有前景的組合是人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）聯(lián)合CA125檢測，但目前美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）僅批準(zhǔn)其用于卵巢癌的復(fù)發(fā)或進(jìn)展監(jiān)測。至今臨床上并未建立適用于早期卵巢癌檢測的腫瘤標(biāo)志物組合，仍需要大量的研究與驗(yàn)證。本文就卵巢癌早期檢測的DNA甲基化標(biāo)志物研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA突變標(biāo)志物

癌癥基因組研究表明腫瘤細(xì)胞的基因組存在大量的遺傳變異。在卵巢癌中，大部分樣本都存在腫瘤蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）基因突變，集中在4～10號外顯子。通過檢測血漿中的循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）可檢測出這些DNA突變。在cfDNA中，一部分為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），它是由腫瘤細(xì)胞通過凋亡、壞死等方式釋放到血液循環(huán)中的DNA片段，攜帶了腫瘤細(xì)胞特異的遺傳及表觀遺傳信息，因此可以用于腫瘤的無創(chuàng)檢測。一些研究嘗試通過檢測血漿、腹腔積液、卵巢囊腫積液等體液中的ctDNA突變進(jìn)行卵巢癌檢測。Krimmel等通過高深度測序在卵巢癌患者的腹腔積液中檢測出低頻

TP53

突變，然而在健康人的對照樣本中也能檢出非常低頻的

TP53

突變。CancerSEEK試驗(yàn)是一個(gè)多中心臨床試驗(yàn)，通過ctDNA結(jié)合蛋白標(biāo)志物檢測8種惡性腫瘤，結(jié)果顯示，其在保證特異度為99%的同時(shí)，對卵巢癌患者的檢測達(dá)到了98%的靈敏度，然而大部分患者為晚期患者，只有9例患者為Ⅰ期。早期卵巢癌的ctDNA突變檢出率明顯低于晚期，即使ctDNA的測序深度在3萬乘以上，早期（Ⅰ/Ⅱ期）卵巢癌檢測的靈敏度也不足68%。根據(jù)GRAIL公司開展的大型隊(duì)列研究——循環(huán)游離基因組圖譜研究（the circulating cell-free genome atlas，CCGA）初步報(bào)道的結(jié)果，在達(dá)到99%特異度時(shí)，即使ctDNA的測序深度達(dá)到6萬乘，Ⅰ～Ⅲ期卵巢癌檢測的靈敏度也只有67%。由此可見，通過檢測ctDNA突變來進(jìn)行早期卵巢癌的檢測達(dá)不到較高的靈敏度，并不是進(jìn)行卵巢癌早期檢測的理想途徑。其原因在于卵巢癌本身的異質(zhì)性，并不是所有的卵巢癌組織都存在DNA突變。根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)庫的信息，81%的卵巢癌組織樣本中存在驅(qū)動基因變異；而在高級別漿液性卵巢癌中，只有73%的患者存在

TP53

突變。ctDNA突變檢測早期卵巢癌的靈敏度不高還可能是由于早期卵巢癌患者的血漿中ctDNA含量很低，有限的血液樣本（一般10 ml）很可能檢測不到帶有突變信息的DNA片段。另外，DNA突變信息不具備組織特異性，容易受其他腫瘤及疾病的干擾。以TP53為例，很多類型的惡性腫瘤中都存在

TP53

突變，甚至很多非惡性腫瘤人群的體液中也存在低水平的

TP53

突變。最后，高深度測序產(chǎn)生的較高成本也是限制該方法在臨床中應(yīng)用的重要因素。

2 DNA甲基化標(biāo)志物

與DNA突變不同，DNA甲基化修飾具有組織特異性、變化范圍廣、潛在靈敏度高等特點(diǎn)，長久以來被認(rèn)為非常適合作為惡性腫瘤早期檢測的標(biāo)志物。DNA甲基化是表觀遺傳修飾途徑之一，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA穩(wěn)定性發(fā)生改變，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要聯(lián)系。在惡性腫瘤發(fā)生之前的癌前病變階段，相較于正常組織細(xì)胞，病變組織細(xì)胞的基因組已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的DNA甲基化修飾。因此，相對于DNA突變而言，DNA甲基化修飾是腫瘤發(fā)生的最早期事件，具有更高的靈敏度與特異度，更適合作為診斷的標(biāo)志物。在卵巢癌細(xì)胞中，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3（forkhead box D3，F(xiàn)OXD3）的高甲基化與腫瘤生長抑制有關(guān)。部分卵巢癌中乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）的沉默也是由其啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致的。除此之外，很多其他基因的表達(dá)也由于啟動子區(qū)的甲基化而受到抑制，包括

DAPK

、

LOT1

、

HOXA10

、

HOXA11

、

CTGF

、

TMS1/ASC

、

PAR4

、

p16

、

SPARC

、

CDH1

、

SFN

、

WT1

等。Melnikov等通過高通量測序方法比較了卵巢癌組織與正常組織的差異甲基化區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包括

BRCA1

、

MLH1

在內(nèi)的10個(gè)基因在卵巢癌組織中高度甲基化，這些基因的組合最高可以達(dá)到69%的靈敏度與70%的特異度，然而這些卵巢癌組織樣本集中于晚期，其對早期卵巢癌的診斷能力并不明確。盡管許多研究報(bào)道了卵巢癌組織中特異的DNA甲基化標(biāo)志物，然而臨床中早期卵巢癌的檢測只有通過體液等無創(chuàng)性的檢測方式才具有可行性。一些研究已經(jīng)報(bào)道了用于卵巢癌早期檢測的血漿DNA甲基化標(biāo)志物（表1），例如

BRCA1

、

OPCML

、

RASSF1A

、

ESR1

等。Ibanez de Caceres等首次報(bào)道了檢測血漿中ctDNA甲基化進(jìn)行卵巢癌診斷的可行性，通過檢測

BRCA1

、

RASSF1A

、

APC

、

p14ARF

、

p16INK4a

、

DAPK

等6個(gè)基因的甲基化水平，靈敏度為82.0%（41/50），特異度為100%（40/40）。Melnikov等采集了33例中晚期卵巢癌患者與33例健康對照者的血漿樣本，通過檢測

BRCA1

、

HIC1

、

PAX5

、

PGR

、

THBS1

等5個(gè)基因的甲基化水平，達(dá)到了85.1%的靈敏度，然而特異度只有61.1%。也有研究僅檢測了卵巢癌患者、卵巢良性腫瘤患者和健康對照者的

OPCML

甲基化水平，也實(shí)現(xiàn)了非常高的靈敏度與特異度。Giannopoulou等采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylationspecificPCR，MSP）分別檢測

RASSF1A

和

ESR1

啟動子的甲基化水平，檢出高級別漿液性卵巢癌的靈敏度分別為62.3%與38.0%。Zhang等采用多重 MSP檢測

APC

、

RASSF1A

、

CDH1

、

RUNX3

、

TFPI2

、

SFRP5

、

OPCML

等7個(gè)基因的甲基化區(qū)域，在41例Ⅰ期上皮性卵巢癌患者的血漿中獲得85.3%的靈敏度和90.5%的特異度。Widschwendter等報(bào)道了一個(gè)與

COL23A1

、

C2CD4D

、

WNT6

相關(guān)的3個(gè)甲基化標(biāo)志物組合，通過高通量測序檢測血漿中的cfDNA來區(qū)分高級別漿液性卵巢癌與健康人群及卵巢良性腫瘤患者，特異度為90.7%，靈敏度為41.4%；并且檢測卵巢癌患者臨床確診前2年之內(nèi)的血漿樣本，在特異度為96.9%時(shí)，靈敏度為23.3%。

表1 卵巢癌早期檢測的DNA甲基化標(biāo)志物

從以上研究報(bào)道可以看出，整體而言，基于cfDNA甲基化檢測卵巢癌可以得到較高的特異度與靈敏度，然而不同研究中得到的靈敏度差異較大。由于這些報(bào)道基本都使用相同的MSP方法進(jìn)行檢測，所以這種差異主要是由于腫瘤的異質(zhì)性、樣本量較小引起的。整體而言，多基因/區(qū)域的甲基化檢測一般比單基因/區(qū)域的檢測得到的靈敏度更高。采用單基因/區(qū)域檢測獲得較高靈敏度的研究很難在大樣本的驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)，例如

OPCML

，其在卵巢癌組織中的高甲基化檢出率一般為33.3%～82.6%，因此，預(yù)期其在大量血漿樣本的驗(yàn)證中也得到先前報(bào)道的接近90%的靈敏度是不現(xiàn)實(shí)的。

基于cfDNA甲基化的卵巢癌早期檢測也面臨著缺乏普遍性的單個(gè)標(biāo)志物、cfDNA含量低引起的穩(wěn)定性差、靈敏度不足等問題。因此，提高卵巢癌早期檢測的準(zhǔn)確性，一方面必須檢測更多、更普遍的標(biāo)志物，另一方面必須提高其在cfDNA中檢測的靈敏度。Guo等基于基因組甲基化測序的數(shù)據(jù)定義了甲基化單倍型塊（methylation haplotype block，MHB），并通過檢測和分析cfDNA中的MHB信息進(jìn)行惡性腫瘤的早期檢測與組織溯源，其信噪比遠(yuǎn)高于平均甲基化水平分析等方法。該方法稱為基于甲基化單體型的非侵入性診斷（methylation haplotyping for non-invasive diagnosis，MONOD）技術(shù)，通過高通量測序覆蓋全基因組400萬個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)，分析和篩選不同cfDNA樣本間差異的MHB。Hong等應(yīng)用該方法檢測cfDNA進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別，靈敏度達(dá)到87.0%，特異度為84.2%。Liu等應(yīng)用該方法檢測cfDNA進(jìn)行胰腺癌的早期檢測，靈敏度達(dá)到68.4%，特異度為90.4%。研究顯示，利用該技術(shù)可在血漿樣本中檢出結(jié)直腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、胃癌的cfDNA甲基化信號，整體特異度為96%，靈敏度達(dá)到88%，甚至在臨床確診前4年的血漿樣本中也檢出了惡性腫瘤信號。另外，Xu等應(yīng)用類似的方法檢測cfDNA進(jìn)行肝癌檢測，靈敏度＞83%，特異度＞90%。在腸癌的無創(chuàng)檢測研究中，類似的方法也取得不錯(cuò)的效果，靈敏度為87.9%，特異度為89.6%。

3 小結(jié)

綜上所述，由于DNA甲基化具有更好的組織特異性，發(fā)生改變的時(shí)期更早、范圍更廣，因此較DNA突變更適合作為惡性腫瘤早期檢測的標(biāo)志物。很多研究已經(jīng)報(bào)道了卵巢癌相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)志物。基于MHB的檢測方法檢測范圍廣、信噪比高，比較適合cfDNA等微量樣本的檢測，尤其適合惡性腫瘤的早期檢測，能夠獲得較高的靈敏度與特異度。隨著高通量測序的發(fā)展，基于MHB的多靶點(diǎn)測序已經(jīng)在腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的早期檢測中實(shí)現(xiàn)比較理想的靈敏度與特異度。因此，利用基于MHB的多靶點(diǎn)檢測進(jìn)行卵巢癌的早期診斷非常值得探索。