Fc γRIIA基因多態(tài)性與急性白血病患兒化療后并發(fā)感染的關(guān)系

劉珍，郭青，朱瑩瑩，蘇淑芳，孫曉敏#

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院1普內(nèi)科，2血液腫瘤科，鄭州 450000

3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒血液腫瘤科，鄭州 450000

急性白血病是造血干細(xì)胞發(fā)生克隆性病變，造成幼稚細(xì)胞和原始細(xì)胞大量增殖，進(jìn)而抑制了生理造血功能所致。急性白血病患者的主要臨床表現(xiàn)是貧血、感染和臟器浸潤等。急性白血病在兒童中的發(fā)病率較高，臨床治療以化療為主。研究顯示，化療可明顯緩解病情，改善預(yù)后，但化療易造成中性粒細(xì)胞缺乏，導(dǎo)致患者機(jī)體免疫功能下降，并發(fā)感染。中性粒細(xì)胞對于機(jī)體抵御病原微生物感染具有重要意義。FcγRIIA是中性粒細(xì)胞表面的FC受體，能夠與免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）結(jié)合，對吞噬作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究分析了

FcγRIIA

基因多態(tài)性與白血病患兒化療并發(fā)感染的關(guān)系，旨在為有效預(yù)防白血病化療后并發(fā)感染提供指導(dǎo)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年6月至2018年6月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的急性白血病患兒的臨床資料，所有患兒均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢查確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。納入標(biāo)準(zhǔn)：適用于世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的造血、淋巴細(xì)胞腫瘤疾病相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)；借助病理學(xué)、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)確診為急性白血病。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在精神障礙，溝通能力較弱；臨床資料不完整；合并免疫系統(tǒng)疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入49例急性白血病患兒，其中，急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患兒19例，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患兒30例；男29例，女20例；年齡5～15歲，平均（10.3±5.6）歲；初治患兒38例（ALL 16例，AML 22例），鞏固性化療患兒7例（ALL 3例，AML 4例），難治復(fù)發(fā)（均為AML）患兒4例。所有患兒均于化療結(jié)束后進(jìn)行細(xì)菌感染分析。根據(jù)化療后是否感染將49例急性白血病患兒分為感染組（

n

=28）和未感染組（

n

=21）。感染組中，男16例，女12例；平均年齡為（10.0±6.0）歲；疾病類型：ALL 10例，AML 18例。未感染組中，男11例，女10例；平均年齡為（10.8±5.4）歲；疾病類型：ALL 9例，AML 12例。兩組患兒的年齡、性別、疾病類型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑及材料

紅細(xì)胞裂解液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq DNA聚合酶mix和T載體試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Ly-6G（Gr-1）流式抗體購自eBioscience公司；BD流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；其他有機(jī)試劑均購自國藥集團(tuán)。

1.3 標(biāo)本采集及處理

采集兩組患者清晨空腹靜脈血5 ml，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）3倍稀釋血樣，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞，收集白細(xì)胞，采用PBS洗滌3次并重懸，細(xì)胞密度調(diào)整為1×10/ml，每毫升細(xì)胞中加入FITC標(biāo)記的Ly-6G（Gr-1）流式抗體1 μg，室溫避光孵育30 min，然后采用PBS洗滌3次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選中性粒細(xì)胞。

1.4 化療后感染評定標(biāo)準(zhǔn)

急性白血病患兒化療后出現(xiàn)感染的評定標(biāo)準(zhǔn)：體溫高于38℃，時間超過2 h；呼吸道、口腔、胃腸道出現(xiàn)感染癥狀。

1.5 Fc γRIIA基因多態(tài)性分析

采用基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA，根據(jù)

FcγRIIA

基因序列設(shè)計引物序列。

FcγRIIA

-F： 5'-ATCCCAGAAATCCTCCCA-3'；

FcγRIIA

-R：5'-ATCCCIAGAAATTCTCCCG-3'；

FcγRIIA

-Rev：5'-CAATTTTGCTGCTATGGGC-3'。以人生長激素基因作為內(nèi)標(biāo)。

Control

-F：5'-CAGTGCCTTCCCAACCATTCCTTA-3'。

Control

-R：5'-ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTGTTTC-3'。PCR反應(yīng)體系：2×Taq DNA聚合酶25 μl，

FcγRIIA

-F 1 μl，

FcγRIIA

-R 1 μl，

FcγRIIA

-Rev 1 μl，cDNA 1 μl，加水補(bǔ)至50 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)，最后降溫至4℃。將部分PCR產(chǎn)物按照T載體使用手冊連接進(jìn)入T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于固體LB平板上，置于37℃培養(yǎng)過夜，次日待菌落生長后，挑取單克隆菌落進(jìn)行測序分析。

1.6 基因多態(tài)性與化療后感染的關(guān)系分析

分析不同

FcγRIIA

基因型患兒化療后骨髓抑制的感染情況以及基因多態(tài)性與化療后并發(fā)感染的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Fc γRIIA基因多態(tài)性情況

測序結(jié)果顯示，

FcγRIIA

基因存在基因多態(tài)性。

FcγRIIA

基因第二個外顯子編碼FcγRIIA蛋白131位氨基酸的基因位點存在多態(tài)性，堿基分別為A或G。等位A堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸為組氨酸H，命名為FcγRIIA-H型；等位G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸為精氨酸R，命名為FcγRIIA-R型；等位A/G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸包括精氨酸R和組氨酸H，命名為FcγRIIA-R/H型。49例急性白血病患兒中，6例患兒為FcγRIIA-R/H型，17例患兒為FcγRIIA-H型，26例患兒為FcγRIIA-R型。（圖1）

圖1 Fc γRIIA基因多態(tài)性分析

2.2 基因型分布情況與急性白血病患兒化療后感染的關(guān)系

未感染組FcγRIIA-H型的表達(dá)頻率明顯高于感染組，F(xiàn)cγRIIA-R型的表達(dá)頻率明顯低于感染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=12.010、8.849，

P

＜0.01）。（表1）

表1 兩組患兒基因型表達(dá)情況的比較[ n（%）]

3 討論

感染是急性白血病化療后的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響白血病化療患兒的預(yù)后。化療后，白血病患兒的中性粒細(xì)胞水平明顯下降。中性粒細(xì)胞在抵御細(xì)菌感染中具有重要作用，除了其數(shù)量的變化外，基因型等內(nèi)在因素是否是化療后感染的易感因素值得深入探討。

中性粒細(xì)胞表面存在許多受體，其中，F(xiàn)c受體在免疫復(fù)合物的吞噬中起著關(guān)鍵作用。FcγRIIA是Fc受體家族成員，部分研究發(fā)現(xiàn)

FcγRIIA

基因存在多態(tài)性，與胃癌、慢性牙周炎和系統(tǒng)紅斑性狼瘡等疾病具有密切關(guān)聯(lián)。但是，目前，關(guān)于

FcγRIIA

基因多態(tài)性與感染關(guān)系的研究報道極少。本研究分析了

FcγRIIA

基因多態(tài)性與白血病患兒化療后并發(fā)感染的關(guān)系，提取了患兒中性粒細(xì)胞基因組，通過分子生物學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)

FcγRIIA

基因第二個外顯子編碼FcγRIIA蛋白131位氨基酸的基因位點存在多態(tài)性，堿基分別為A或G。等位A堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸為組氨酸H；等位G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白質(zhì)131位氨基酸為精氨酸R；等位A/G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白質(zhì)131位氨基酸包括精氨酸R和組氨酸H。本研究進(jìn)一步對感染者和未感染者的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)未感染組FcγRIIA-H型的表達(dá)頻率明顯高于感染組，而FcγRIIA-R型的表達(dá)頻率明顯低于感染組。說明白血病患兒化療并發(fā)感染與患兒的

FcγRIIA

基因多態(tài)性密切相關(guān)。從分子機(jī)制而言，

FcγRIIA

基因多態(tài)性導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的氨基酸存在差異，使編碼蛋白質(zhì)與IgG的結(jié)合能力發(fā)生變化，而IgG的結(jié)合能力在抵抗病原微生物感染中發(fā)揮著重要作用。若

FcγRIIA

基因編碼蛋白質(zhì)131位氨基酸為組氨酸H，則增強(qiáng)了FcγRIIA蛋白與IgG的結(jié)合能力，從而增強(qiáng)了其對病原微生物的殺傷能力，減少了感染的可能性。反之，若

FcγRIIA

基因編碼蛋白質(zhì)131位氨基酸為精氨酸R，則與IgG的親和力減弱，增加了感染的可能性。綜上所述，

FcγRIIA

基因多態(tài)性是造成白血病患兒骨髓抑制期出現(xiàn)感染的原因之一，本研究有望為白血病患兒骨髓抑制期感染提供一定的預(yù)防依據(jù)。但是，本研究納入的白血病患兒病例數(shù)較少，需要多中心、前瞻性的研究進(jìn)一步分析、討論。