縫隙連接蛋白43與 B-連環(huán)蛋白在皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)及臨床意義分析

王娜，李彩霞，袁肖海

上海市皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容科，上海 200443

皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）為高度惡性腫瘤，由皮膚組織及黏膜黑色素細(xì)胞惡性分化而成。CMM預(yù)后較差，且中國近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢。盡管對CMM的臨床研究較多，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。縫隙連接蛋白（connexin，Cx）作為跨膜蛋白家族在細(xì)胞間縫隙連接中起到通訊作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20余種，以Cx43多見且廣泛表達(dá)。近年來研究表明，Cx43表達(dá)能介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。Cx43通過C端域的結(jié)合位點(diǎn)與各種蛋白相互作用，可充當(dāng)腫瘤抑制因子發(fā)揮抑癌作用。B-連環(huán)蛋白（B-catenin）由B連環(huán)蛋白1（catenin beta 1，CTNNB1）基因編碼，是一種高保守的多功能分泌型蛋白，參與構(gòu)成WNT/B-catenin信號通路發(fā)揮作用。B-catenin一方面通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子促使自身向靶細(xì)胞質(zhì)聚集、核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力受影響，另一方面自身可經(jīng)過相應(yīng)糖基化修飾與卷曲蛋白結(jié)合觸發(fā)信號級聯(lián)通路而影響胚胎發(fā)育及人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。因此，Cx43、B-catenin的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前雖有研究顯示Cx43、B-catenin與CMM發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但相關(guān)研究較少，且鮮有在CMM患者中同時(shí)檢測兩種指標(biāo)表達(dá)與CMM發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系研究。故本研究探討Cx43與B-catenin在CMM中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年2月至2020年2月上海市皮膚病醫(yī)院收治的CMM患者的病歷資料，每位患者均已取得腫瘤組織和癌旁正常皮膚組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次發(fā)病；年齡≥18歲；參照相關(guān)指南標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理檢查確診為CMM；行手術(shù)治療；術(shù)前無抗腫瘤治療史；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴其他類型惡性腫瘤；伴先天性疾病；伴心、肺等嚴(yán)重器官功能障礙；伴肝腎功能不全；伴嚴(yán)重免疫系統(tǒng)性疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入75例CMM患者，其中男39例，女36例；年齡39～76歲，平均（57.15±9.76）歲；發(fā)病部位：四肢50例，其他部位25例；美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例，Ⅳ期14例；腫瘤直徑≤4 cm 35例，＞4 cm 40例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quan-titative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）法測定

Cx43

相對表達(dá)量將組織樣本（直徑1.0 cm）放于-80℃環(huán)境保存，通過RNA提取試劑盒（上海睿時(shí)生物科技有限公司）提取總RNA，用焦碳酸二乙酯溶解RNA，使用紫外分光光度計(jì)測其濃度和純度，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海睿時(shí)生物科技有限公司）在由4.0 μl模板、5倍緩沖液 2.0 μl、焦碳酸二乙酯 4.0 μl構(gòu)成的反應(yīng)體系中將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR定量反應(yīng)測定Cx43的表達(dá)水平，反應(yīng)體系為 4.0 μl模板、Premix Ex TaqⅡ2.0 μl、上游引物及下游引物各1.0 μl、焦碳酸二乙酯12.0 μl，在95 ℃下預(yù)變性5 min、95 ℃下變性5 s、60℃退火30 s，共循環(huán)40次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參（相對含量為1），根據(jù)目的基因和內(nèi)參計(jì)算相對表達(dá)量。按本研究中腫瘤組織的

Cx43

相對表達(dá)量的中位數(shù)0.80為臨界值，將患者分為低表達(dá)組37例和高表達(dá)組38例，分組方法參考有關(guān)文獻(xiàn)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測 B-catenin將CMM患者的腫瘤組織和癌旁皮膚組織的石蠟切片切為厚3.0 μm的薄片，脫蠟后通過免疫組織化學(xué)染色法將標(biāo)本染色。首先用0.5%高錳酸鉀浸泡水洗5～20 min，再用1.0%草酸浸泡2～5 min實(shí)現(xiàn)脫色（通過腫瘤組織大小和鏡下觀察脫色度具體判定），脫色后對抗原熱修復(fù)25 min，將薄片置于3.0% HO室溫下孵育12 min，經(jīng)小牛血清封閉液在常溫下反應(yīng)15 min后去除封閉液，隨后滴加B-catenin免疫組化一抗，1∶500稀釋，甩去封閉液封閉，4℃環(huán)境下孵化過夜。復(fù)溫50 min后用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物免疫組織化學(xué)劑孵育0.5 h，二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，蘇木素再染色5 min后用氨水返藍(lán)、清洗、脫水、固定封片即可鏡下觀察。

1.2.3 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)B-catenin陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核在鏡下可見棕褐色顆粒物，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評分綜合判定是否為陽性表達(dá)。染色強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評分的乘積，0分為B-catenin陰性，≥1分為B-catenin陽性表達(dá)。

1.2.4 臨床特征收集患者性別、年齡、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況資料均源自病史記錄；腫瘤大小通過皮膚鏡檢查測量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CMM組織與癌旁組織中Cx43相對表達(dá)量的比較

CMM組織中

Cx43

相對表達(dá)量為（0.769±0.213），明顯低于癌旁組織的（1.081±0.236），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=33.043，

P

=0.000）。

2.2 CMM組織與癌旁組織中 B-catenin陽性表達(dá)率的比較

CMM組織中B-catenin陽性表達(dá)率為68.00%（51/75），明顯高于癌旁組織的21.33%（16/75），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=33.043，

P

=0.000）。

2.3 不同Cx43、 B-catenin表達(dá)情況的CMM患者臨床特征的比較

Cx43低表達(dá)CMM患者TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、腫瘤大小＞4 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例分別明顯高于高表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=7.090、11.317、11.522，

P

＜0.01）；B-catenin陰性表達(dá)CMM患者TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、腫瘤直徑＞4 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例分別低于陽性表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=17.653、5.672、5.402，

P

＜0.05）；不同Cx43、B-catenin表達(dá)情況的CMM患者性別、年齡、發(fā)病部位比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表1）

表1 不同Cx43、 B-catenin表達(dá)情況的CMM患者的臨床特征（ n=75）

2.4 Cx43、 B-catenin的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析

Cx43表達(dá)與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.01），B-catenin表達(dá)與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（

P

＜0.01）。（表2）

表2 Cx43與 B-catenin的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析

3 討論

CMM始發(fā)于皮膚，由于惡性程度高，轉(zhuǎn)移后迅速蔓延并危及生命，常規(guī)化療效果欠佳，增強(qiáng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞殺傷作用是目前的研究重點(diǎn)。細(xì)胞縫隙連接通訊可傳遞免疫信息，Cx43在免疫細(xì)胞中高表達(dá)，研究表明Cx43可允許抗原交叉呈遞進(jìn)而促使腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，在腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Cx可用于形成連接子，允許代謝物排出和小分子物質(zhì)交換促進(jìn)細(xì)胞間代謝平衡、細(xì)胞外內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，Cx43作為最為多見的Cx，如果表達(dá)出現(xiàn)異常可造成細(xì)胞間代謝失衡、細(xì)胞外內(nèi)環(huán)境紊亂進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞出現(xiàn)惡性增殖和分化。WNT/B-catenin通路與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲作用有關(guān)，B-catenin是WNT/B-catenin重要的節(jié)點(diǎn)，可通過與鈣黏蛋白作用參與細(xì)胞間黏附。研究表明B-catenin表達(dá)可下調(diào)鈣黏蛋白水平，因此B-catenin異常表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞間黏附作用減小、松散，進(jìn)而提高腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，Cx43及B-catenin表達(dá)異常與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。由于CMM發(fā)病機(jī)制尚不明確，Cx43與B-catenin在CMM中的表達(dá)水平及意義研究較少，故本研究重在研究Cx43與B-catenin在CMM中的表達(dá)水平，并分析其臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，CMM組織中Cx43相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，CMM組織中Cx43表達(dá)與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān)，這與王峻嶺等和張冀北等的研究結(jié)果相一致。腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞增殖分化程度高于癌旁組織，腫瘤細(xì)胞增殖旺盛卻不會(huì)調(diào)亡的主要原因是免疫反應(yīng)被削弱，可能原因是Cx43低表達(dá)造成抗原呈遞作用減弱進(jìn)而降低腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞殺傷作用，使腫瘤細(xì)胞增殖分化不受阻礙，侵襲作用增強(qiáng)，惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程加快，腫瘤相對較大且更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。CMM組織中B-catenin陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，B-catenin表達(dá)與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，這與戴云飛的研究結(jié)果相一致。正常細(xì)胞間黏附作用較強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)信息交流和物質(zhì)交換，而腫瘤細(xì)胞則相反，通過減弱細(xì)胞間黏附作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫落，然后發(fā)生惡性增殖和轉(zhuǎn)移，可能原因是B-catenin過表達(dá)會(huì)降低鈣黏蛋白水平，從而降低細(xì)胞間黏附作用，增加腫瘤細(xì)胞脫落和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。此外B-catenin高表達(dá)會(huì)使WNT/B-catenin通路持續(xù)處于激活狀態(tài)，使通路中下游分子突變，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此惡性程度高、相對較大的腫瘤更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Cx43在CMM組織中低表達(dá)，B-catenin在CMM組織中高表達(dá)，且Cx43、B-catenin表達(dá)情況與CMM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。