HPLC-FLD法測定油茶籽油中苯并(a)芘的含量

唐后樂

（邵陽學院，湖南邵陽 422000）

油茶籽受到高溫焙炒,特別是壓榨過程又受到高溫、高壓的作用,就會產生苯并(a)芘[Benzo (a) Pyrene，B(a)P ]，它是一種多環芳烴（PAHs）類化合物，對人體有著較大影響，過量攝入有可能致癌[1-2]。為保障人們的身體健康，應對油茶籽油制備檢測精準度提出較高要求，從而獲取準確的苯并(a)芘含量數據[3]。油茶籽油制備流程較為復雜，且制備過程中易受多種因素的干擾，加大了苯并(a)芘檢測難度[4]。本文嘗試選取LC-PAHs專用液相色譜柱作為制備處理工具，提出一種HPLC-FLD法檢測方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽脫酸油、浸提油茶籽毛油、壓榨油茶籽毛油，采用自制方式獲取；不同種類的品牌市售油茶籽油，編號1～8，采購于沃爾瑪超市；丙酮、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇，均為色譜純（AR），由Tedia公司提供。

本研究短期觀察結果顯示，MSDAR和PETD均能有效治療青少年腰椎間盤突出癥。在嚴格把握手術適應證、熟練掌握技術的前提下，MSDAR安全可靠有效，尤其對于椎間盤退變等級為Ⅲ級的LDH患者，行纖維環縫合可提高術后髓核“再水化”，有助于促進患者腰椎功能恢復。但本研究樣本量較小，隨訪時間較短，遠期兩組患者療效仍有待觀察。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；LC-PAHs色譜柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），美國Supeleo；配熒光檢測器，美國安捷倫公司；固相萃取裝置，美國 Supeleo；TDL-80-2B型離心機，上海安亭科學儀器廠；堿性氧化鋁柱，博納艾杰爾科技；HiCapt Benzo型固相萃取柱，維泰克科技（武漢）有限公司；弗羅里柱，德國Simon Aldrich；C18柱，博納艾杰爾科技；Turbo VapO LV型氮氣吹掃裝置，美國Biotage；硅膠柱，德國Simon Aldrich。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

（3）固相萃取洗脫劑的用量。為了確定更為精準的固相萃取洗脫劑用量，本實驗在B(a)P標準工作液上樣過柱，而后對其采取洗脫處理。其中，洗脫劑的添加量為5 mL，分5次洗脫，每次洗脫用量 1 mL。操作過程中，控制洗脫速度，要求耗時70 s完成一次洗脫。分別檢測每洗脫一次后的B(a)P回收率，并記錄檢測結果。

1.3.2 樣品前處理

上海市于2015年6月出臺了《關于進一步推進本市社區衛生服務綜合改革與發展的指導意見》，推行由1家社區衛生服務中心、1家區級醫院和1家市級醫院組成的“1+1+1”組合，為簽約糖尿病居民提供分級診療服務[5]。

（2）樣品凈化。選取真空固相萃取裝置作為凈化工具，按照以下4個操作步驟，對樣品采取凈化處理。①樣品活化處理。以固相萃取柱作為實驗器皿，向其中添加丙酮、正己烷，用量分別為5.2 mL、 2.2 mL，攪拌均勻，使得器皿內環境得以活化。②上樣。將第一步提取的2 mL上層溶液加入器皿中，控制流速1 mL/min。③淋洗。取3 mL正己烷和乙酸乙酯，按照體積為4∶1的比例混合，利用此部分混合液淋洗固相萃取柱，而后棄去淋洗液，并抽干小柱。④用3 mL丙酮洗脫樣品，控制洗脫流速2.1 mL/min。將所有樣品洗脫液收集起來，放置在50 ℃環境中，以氯作為媒介吹干樣品，向器皿中添加0.5 mL甲醇，采用渦旋方式處理，使得樣品得以溶解，完成定容操作，形成1 mL樣品，將其裝入樣瓶中，等待檢測。

為了提高實驗檢測結果精準度，本次實驗對儀器的使用條件進行了限定，同時對檢測器的作業參數進行了設置。本實驗采用專用液相色譜柱LC-PAHs創造色譜柱實驗條件，控制進樣量為10 μL，保持柱溫恒定在30 ℃左右。按照1∶1的配比，將水和乙腈混合在一起，注入器皿中，控制流速1.0 mL/min。關于檢測器作業參數的設定，按照國家測定標準，設置作業波長為324 nm，激發波長270 nm，檢測作業時間29 min。

1.3.3 苯并(a)芘檢測方法

（1）B(a)P固相萃取柱的選取。本次實驗選取4種固相萃取柱作為實驗裝置，包括HiCapt Benzo固相萃取柱、佛羅里硅土柱、C18柱、堿性氧化鋁柱。以濃度為10 μg/L的B(a)P甲醇溶液作為實驗材料，用量0.5 mL，吸附在不同類型固相萃取柱上，重復3次操作，采用與前文相同的方法采取洗脫處理，完成固相萃取柱丙酮洗脫，經過濃縮定容后，轉移到檢測儀器上。通過觀察儀器上B(a)P的吸附效果，給出相應判斷。按照本實驗方案設計的正己烷的萃取用量、凈化上樣用量，對實際回收率進行調整，計算如下：

式中：M0為空白樣品測定值；μg/kg；M1為加標樣品測定值；μg/kg；Z為加標量；μg/kg。

2.1.1 B(a)P固相萃取柱

取1ml的B(a)P標液，向其中加入甲醇，將其稀釋成1mg/L的標準儲備溶液，冰箱中4 ℃下密封 保存[5]。

1.3.4 色譜條件

從回歸分析結果看，可決系數為0.6579，調整后的可決系數,達到0.6389，說明所建模型整體上對樣本數據擬合較好，同時，在95%的置信度水平下LnFIR系數通過了t統計檢驗，表明深圳市金融資產規模對經濟增長有顯著性影響；LnFIR與LnGDP之間的相關系數為3.9810，說明LnFIR與LnGDP之間存在高度的正相關。由此可以證明，金融支持與經濟發展之間的關系是正相關的，金融的發展會推動經濟的發展，符合理論分析中金融支持對經濟發展的促進作用。

2.1.2 固相萃取洗脫劑

(3) 液壓振動：利用液壓力作為振動的能量來源，相比于機械振動和超聲波振動，液壓振動的振幅可以更大，振動的精度更加精確。

2 結果與分析

2.1 苯并(a)芘檢測方法的確定

（2）固相萃取洗脫劑的選取。實驗選擇4種洗脫溶劑作為實驗材料，包括甲醇洗脫劑、二氯甲烷洗脫劑、丙酮洗脫劑、乙腈洗脫劑，利用這4種洗脫劑，完成固相萃取柱洗脫處理，檢測B(a)P的回收率。實驗中，控制其他參數保持不變。

我得說，坐擁保時捷911 Carrera RS 2.7只要有錢就行，但要想充分發揮它所蘊藏的潛力，絕非是一件易事。如果你能擁有R?hrl Walter的駕駛技術，那也沒有問題，畢竟他早在40多年前就和這輛特殊的保時捷融為一體了。雖然，以今天的標準來衡量這輛身價奇高的保時捷，它各方面都顯得有些松松垮垮的了。

按照1.3.2（1）中方法測定B(a)P固相萃取柱回收率結果如下：①HiCapt Benzo固相萃取柱添加洗脫劑為丙酮，加標量為10.5 μg/L，測得固相萃取柱回收率為（92.30±0.45）%；②佛羅里硅土柱添加洗脫劑為丙酮，加標量為10.5 μg/L，固相萃取柱回收率為（85.65±0.77）%；③C18柱添加洗脫劑為二氯甲烷，加標量為10.5 μg/L，固相萃取柱回收率為（88.43±0.45）%；④堿性氧化鋁柱添加洗脫劑為二氯甲烷，加標量為10.5 μg/L，固相萃取柱回收率為（53.60±1.55）%。

檢測結果顯示，本實驗選取的4種固相萃取柱的吸附回收率數值差異較為顯著（p＜0.05），由此可以判斷，固相萃取柱的類別對B(a)P的吸附作用差異顯著。另外，通過對比4種固相萃取柱的吸附回收率數值，HiCapt Benzo數值最大，回收率為（92.30±0.45）%。所以，應該選擇HiCapt Benzo作為B(a)P固相萃取柱。

在水泥水化放熱過程中，放熱速度與放熱最高峰時釋放出來的熱量，會對水泥水化反應過程的進度產生重要的影響[2]。一般來講，溫度升高會促進水泥的水化反應，而水化反應的加快會進一步放出熱量，這樣會導致混凝土的內外溫差大，最終因為熱脹冷縮而產生裂縫。裂縫對混凝土強度和密實度的影響很大，并最終影響到工程的整體結構安全和使用功能。所以，控制水泥的水化速度至關重要。

觀察比較干預前后的空腹血糖、餐后2小時血糖以及糖化血紅蛋白（hba1c）變化情況，糖尿病知識掌握情況，服藥依從性和生活方式改善情況。

測試結果顯示，甲醇洗脫劑應用下B(a)P的回收率為72.56%，二氯甲烷洗脫劑應用下B(a)P的回收率為90.01%，丙酮洗脫劑應用下B(a)P的回收率為92.54%，乙腈洗脫劑應用下B(a)P的回收率為76.08%。

與乙腈洗脫劑、甲醇洗脫劑相比，甲醇洗脫劑和二氯甲烷洗脫劑應用下B(a)P的回收率更高，優勢更為顯著。由此可以推斷，這兩種洗脫劑對B(a)P的洗脫影響更大。由于二氯甲烷自身基質容易遭受干擾，不利于得到準確的檢測結果。因此，丙酮是最佳洗脫劑。

（1）提取樣品。采用稱量的方式，從樣品中提取部分油茶籽油樣品，重量為0.5 g，將此部分樣品放置于聚丙烯離心管中，器皿容積為50 mL。向器皿中加入正己烷，用量3.1 mL，采用渦旋方式混合兩部分樣品，持續時間70 s。向器皿中添加超純水，用量2.2 mL，繼續采用渦旋方式混合兩部分樣品，持續時間70 s，按照4 000 r/min速度離心，持續180 s。提取溶液中的上層溶液，提取量為2 mL。

2.1.3 固相萃取洗脫劑

檢測結果顯示，丙酮洗脫體積為1 mL時，B(a)P回收率為52.29%±1.93%aA；丙酮洗脫體積為2 mL時，B(a)P回收率為73.60%±1.05%aB；丙酮洗脫體積為3 mL時，B(a)P回收率為92.23%±0.59%aC；丙酮洗脫體積為4 mL時，B(a)P回收率為92.04%±0.59%aC；丙酮洗脫體積為5 mL時，B(a)P回收率為91.94%±0.95%aC（大寫字母代表差異極顯著，p＜0.05，小寫字母代表差異顯著，p＜0.01）。

上述檢測結果中，與丙酮1～2 mL用量相比，使用3～5 mL丙酮洗脫時，B(a)P回收率差異顯著性較強（p＜0.01）。當丙酮用量達到3 mL時，回收率出現了明顯增加，而后隨著用量的增加，回收率并沒有出現增加變化趨勢，而是開始小幅度下降，并且回收率變化差異顯著性較差（p＞0.05）。3～5 mL丙酮洗脫對B(a)P回收率影響較小，從環保角度出發應盡可能減少丙酮用量，所以3 mL用量為最佳。綜上檢測分析，最佳苯并(a)芘檢測方法：選取HiCapt Benzo作為固相萃取柱，利用丙酮完成固相萃取柱洗脫，控制用量為3 mL。

4.在領用材料的生產制作過程中存在串料、替代料使用的現象，且在過程中沒有留下相應的信息軌跡，導致無法歸集至相應成本對象。

2.2 精煉程度不同條件下油茶籽油B(a)P加標回收率的測定

本實驗選取浸提油茶籽毛油、壓榨油茶籽毛油、市售某品牌油茶籽油、油茶籽脫酸油作為樣本，設置樣本數量為6份，分別將這些樣本放入聚丙烯離心管（容積25 mL）中。設置空白對照組3份，實驗組3份，即每一種樣本拆分為兩部分，其中3份添加B(a)P標準工作液，用量500 μL（10 μg/L），振蕩搖勻，而后放在檢測儀上，獲取B(a)P加標回收率，并計算加標樣品平均檢測值，結果如表1所示。

表1 精煉程度不同條件下油茶籽油B(a)P加標回收率測定結果

目前，應用比較多的B(a)P加標回收率檢測方法為反相高效液相色譜法，利用該方法檢測到的油茶籽油B(a)P含量（回收率）均值為93.2%，而本文提出的檢測方法，測得4種油茶籽油中B(a)P回收率均超過了93.2%。其中，壓榨油茶籽毛油的B(a)P回收率達到了104.49%。由此看來，本文提出的檢測方法得到的B(a)P回收率較高。另外，當前應用比較多的氧化鋁活度測定法，加標量相同情況下得到的樣品平均檢測值為（8.838±0.497）μg/kg，該數值明顯低于本文提出的檢測方法。本次檢測中，樣品平均檢測最小值為（8.871±0.076） μg/kg。因此，本文提出的B(a)P檢測方法實際應用價值較高。

2.3 8種油茶籽油中苯并(a)芘含量的檢測

采用與實驗2相同的檢測方法，選取8種不同的樣品，均為品牌市售油茶籽油，每種樣品準備6份，每一種樣本拆分為兩部分，設置空白對照組3份，實驗組3份。每份樣品單獨放入聚丙烯離心管（容積25 mL）中，向裝有實驗組樣品的器皿中添加B(a)P標準工作液，用量500 μL（10 μg/L），振蕩搖勻，而后放在檢測儀上，獲取苯并(a)芘含量數據，同時檢測未添加B(a)P標準工作液的樣品苯并(a)芘含量，結果如表2所示。兩種方法下產生的8種品牌油茶籽油中苯并(a)芘含量檢測結果差異較小，相比之下，國標檢測方法應用下得到的苯并(a)芘含量更高。從整體來看，本文提出的檢測方法在穩定性能方面具備較大優勢，可以得到比較精準的檢測結果，不易受外界因素干擾，與當前已經取得的研究成果相比，該檢測方法更貼近正確數值，可作為油茶籽油中苯并(a)芘檢測工具。

表2 兩種檢測方法下油茶籽油中苯并(a)芘含量檢測結果對比表（單位：μg/kg）

4 結論

本文圍繞油茶籽油中苯并(a)芘檢測方法展開研究，針對傳統檢測方法存在的不足，提出一種基于HPLC-FLD法的檢測方法。該方法利用LC-PAHs專用液相色譜柱作為主要實驗裝置，通過合理選取固相萃取柱種類、固相萃取洗脫劑種類，確定最佳洗脫劑用量，形成完整的苯并(a)芘檢測方法。精煉程度不同條件下油茶籽油B(a)P加標回收率測定、8種油茶籽油中苯并(a)芘含量檢測結果顯示，本文提出的B(a)P檢測回收率較反相高效液相色譜法的B(a)P回收率更高，并且較氧化鋁活度測定法的加標量相同情況下得到的樣品平均檢測值更高，更加貼近正確數值，具有較高的應用價值。