米糠抗氧化劑的制備及其抗氧化能力研究

仇保杰，李 亮，周亞明，石 垚

（西安培華學院，陜西西安 710125）

油脂作為食品中不可缺少的重要成分之一，不僅能提供熱量，還能提供人體無法合成而必須從食品中獲取的必需脂肪酸（如亞油酸等）及供給各類脂溶性維生素。我國作為小米糠的生產大國，每年都會生產大量小米糠。近年來，國內的研究大多集中在稻谷加工的副產物大米糠，而對于小米糠的研究及領域利用僅主要局限于作為飼料供動物使用[1]，盡管原料并不昂貴，成本較低，但一定程度上依然造成了小米糠資源的大量浪費。

我國是農業大國，已開始對油脂加工業進行保護并進行合理利用。小米糠油是指利用壓榨、溶劑浸出或多種方式結合的方法制得的植物油脂，含有符合人們身體需要的營養成分，它不但為人體提供營養，還可以降低血脂、抑制黑色素成長、促進人體吸收，幫助人體消化。亞油酸作為米糠油脂肪酸的主要成分和人體的必需脂肪酸，是一種天然抗氧化物，具有防癌抗癌、抗粥狀動脈硬化、參與脂肪分解與新陳代謝、增強肌體免疫能力、促進骨組織的代謝等作用[2,5]，可以減少化學抗氧化劑帶來的一些弊端，具有重要的保健和臨床意義。本試驗利用索氏提取法提取米糠油，采用尿素包合法純化亞油酸，將其加工為抗氧化劑，并研究其抗氧化能力，為小米糠深度開發利用和產業化生產提供理論 依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮米糠，由陜西榆林地區所產；小米糠油，為索氏提取法制備所得到的小米糠油。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

正己烷、石油醚、1%硫酸-甲醇溶液、5%的氫氧化鈉乙醇溶液、濃鹽酸、無水硫酸鈉、無水乙醇、尿素、聚甘油蓖麻醇酯，分析純。

1.2.2 儀器

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、電熱恒溫水浴鍋、旋轉蒸發儀、202型電熱恒溫干燥箱、JA003電子天平、氣相色譜儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米糠基本營養簡介

小米糠和小米中的主要營養成分以及維生素含量的比較見表1、表2。

表1 小米糠和小米的主要營養成分比較[3]

表2 小米糠和小米中維生素含量的比較[3]

1.3.2 小米糠油的提取方法

稱取一定數量的小米糠包在濾紙內，置入索氏提取器中，按照1∶20（g/mL）的物料比加入有機溶劑（如正己烷），提取溫度為70 ℃，水浴回流提取 7 h（直至浸液基本無色）后，對提取液進行蒸餾，回收溶劑，將得到的小米糠油稱重，計算小米糠油的出油率[4]。小米糠油的出油率計算如下：

1.3.3 混合脂肪酸的制備

將上述得到的小米糠油樣置于圓底燒瓶中，按1∶20（g/mL）的比例在瓶中加入5%氫氧化鈉乙醇溶液，用磁力攪拌器攪拌試驗溶劑，用水浴鍋緩慢加熱至70 ℃，恒溫回流2 h。同時將試驗得到的皂化液放置冷卻至室溫，于皂化物中加入適量蒸餾水，使之完全溶解。然后再加入1 mol/L的鹽酸溶液將pH值調至2～3后，將溶液置于分液漏斗中，加入約10 mL（1∶10）正己烷進行萃取與分離，緊接著加入適量蒸餾水將油層的pH值調至中性，使用無水硫酸鈉除去溶液中的水分，蒸去正己烷，即可得混合脂肪酸。

1.3.4 尿素包合法純化亞油酸

將上一步試驗最終所得的混合脂肪酸，先按1∶5∶150（g/g/mL）的比例分別加入混合脂肪酸、尿素和無水乙醇至烘干的250 mL圓底燒瓶中，使用恒溫水浴鍋對其進行加熱，恒溫加熱并使用球形冷凝管回流。在試驗過程中需集中觀察尿素溶解情況，當尿素完全溶解于該混合溶劑時，將圓底燒瓶自恒溫水浴鍋中取出，冷卻放置，直至室溫。再將該混合溶液存放于5 ℃環境約30 h。取出后以最快的速度進行減壓抽濾，除去結晶，再將所得濾液進行蒸餾蒸去乙醇。然后使用正己烷對剩余溶劑進行萃取，加入蒸餾水洗直至無尿素后，采用無水硫酸鈉干燥，最后蒸去正己烷，即可得亞油酸。

1.3.5 脂溶性亞油酸抗氧化劑的制備

精密稱取一定量經1.4.1和1.4.2分析后所得的亞油酸，將其溶解于裝有一定質量純凈水的燒杯中，再將稱量好的乳化劑PGPR按一定比例加入燒杯中混合[6]。然后將燒杯固定在攪拌器的臺面上，在室溫條件下將上述物質按質量比用攪拌器混合攪拌，直至形成半固態膠狀物質，取出，即得脂溶性亞油酸抗氧化劑。

1.4 分析方法

1.4.1 脂肪酸甲酯的制備

稱取制得的混合脂肪酸5 mg放置于圓底燒瓶中，再在其中加入1%的硫酸和2 mL的甲醇，將圓底燒瓶放入水浴鍋中加熱30 min，控制溫度為70 ℃。 0.5 h后，加入2 mL正己烷，待上清液分離后，加入1 mL正己烷再次進行萃取，分離上清液。最后將兩次所得上清液合并，等待測量。

1.4.2 氣相色譜分析條件

使用GC1120（FID）氣相色譜儀對于試驗所得到的混合脂肪酸甲酯進行氣相分析：載氣要求為氮氣；前進樣口溫度為280 ℃；后進樣溫度為250 ℃；前檢測器溫度為270 ℃；后檢測溫度為100 ℃；柱流量為0.6 mL/min；分流比為60∶1；進樣量 為1 μL。

1.4.3 亞油酸得率分析

亞油酸得率按文獻[4]的方法進行計算，計算公式如下：

1.5 亞油酸抗氧化劑的抗氧化活性測定1.5.1 DPPH自由基的清除作用

參考文獻[7-10]，采用DPPH法以測定該氧化劑的清除DPPH自由基能力，測定波長為517 nm。

將2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH的無水乙醇溶液與2 mL具有不同濃度的待測樣品于試管中混合。再將該混合物于25 ℃遮光放置60 min，在517 nm波長處測定吸光度為A1；并使用無水乙醇為空白對照，測定吸光度為A0；同時以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度為A2。以維生素C為陽性對照，將無水乙醇置于樣品池內用于扣除空白。每組平行測定3次。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中：A0為2 mL DPPH無水乙醇溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH無水乙醇溶液 +2 mL樣品溶液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇溶液+2 mL樣品溶液吸光度。

1.5.2 ABTS自由基的清除作用

采用ABTS法以測定該劑的清除ABTS自由基能力，測定波長為734 nm。

參考文獻[7-10]，向原樣品加入60%乙醇液，再將其稀釋為不同濃度的待測樣品，使其充分混勻。取0.2 mL各濃度樣品溶液，加入3.9 mL ABTS自由基溶液，混勻，于背光處靜置15 min，測定溶液在734 nm處的吸光度，計算ABTS自由基清除率。以維生素C為陽性對照，將無水乙醇置于樣品池內用于扣除空白。每組平行測定3次。ABTS自由基清除率計算如下：

式中：A0為3.9 mL ABTS自由基溶液＋0.2 mL無水乙醇的吸光度；A1為3.9 mL無水乙醇＋0.2 mL樣品溶液的吸光度；A2為3.9 mLABTS自由基溶液＋0.2 mL樣品溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 小米糠油的油質和出油率結果

對于提取小米糠油的最佳有機溶劑的選擇，結果如表3所示。由表3可知，在相同試驗條件下，相對來說，使用正己烷來提取小米糠油，出油率較高且油質清澈，為較理想的提取劑。使用異丙醇的出油率最高，但其出油油質渾濁。利用無水乙醇作溶劑時，提取率低，油脂質量差，且兩者之間有部分酯化反應的進行。石油醚的出油率最低，而且石油醚對人體的危害也比較大，屬于易燃溶劑。因此，本次試驗選擇使用正己烷來提取小米 糠油。

表3 有機溶劑的選擇對小米糠油的出油率和油質的影響

2.2 氣相色譜分析和尿素包合法結果

根據氣相色譜分析的條件，將試驗制得的混合脂肪酸甲酯和標準混合脂肪酸甲酯進行分析，結果如圖1所示。所得質譜圖經標準譜圖檢索，確認其脂肪酸甲酯成分，同時應用峰面積歸一化法求得各脂肪酸甲酯成分的相對含量，見表4。

圖1 對照品與標準品混合脂肪酸甲酯化色譜圖

本試驗將制得的混合脂肪酸和標準混合脂肪酸甲酯化后對其進行氣相分析，確定脂肪酸甲酯的成分。由表4可知，將小米糠油甲酯化后共檢出11種脂肪酸甲酯，即11種脂肪酸，其中，亞油酸含量最高（30.01%），其次是棕櫚酸（22.83%），反式油酸（24.96%），硬脂酸（8.13%），花生四烯 酸（4.03%）等。

表4 混合脂肪酸甲酯的相對含量

當混合脂肪酸、尿素和無水乙醇之比為1∶5∶ 150（g/g/mL），包合溫度為5 ℃，包合時間為30 h時，尿素包合亞油酸得率按1.4.3計算為64.45%。

2.3 亞油酸抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力

DPPH是一種評價抗氧化劑清除自由基效果的方法。以維生素C為陽性對照，同法測定DPPH自由基清除率，結果如圖2所示。由圖2可知，隨著亞油酸抗氧化劑濃度的增加，DPPH自由基清除率增加，呈現濃度依賴性。從整體上看，在相同質量濃度下，亞油酸抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力略低于維生素C。

圖2 亞油酸抗氧化劑DPPH自由基清除率

2.4 亞油酸抗氧化劑對ABTS自由基的清除能力

以維生素C為陽性對照，同法測定，結果如圖3所示。由圖3可知，亞油酸抗氧化劑對ABTS自由基的清除率呈濃度依賴性，與DPPH抗氧化活性顯相同的趨勢及性質。但從清除率曲線可見，在相同質量濃度下，亞油酸抗氧化劑對ABTS自由基的清除能力比維生素C更弱，但隨著濃度的增加稍低于維生素C對ABTS自由基的清除能力。

圖3 亞油酸抗氧化劑ABTS自由基清除率

3 結論

我國具有天然豐富且優質的小米糠資源，但目前國內外對其研究大多集中于稻谷加工的副產物大米糠或用于直接喂養家禽等動物，其附加值及利用率較低，一定程度上造成了資源的浪費。本文以小米糠為原料，提取小米糠油，利用尿素包合法從小米糠油中分離純化亞油酸并加入PGPR、水制成了一種天然抗氧化劑的深加工產品。通過試驗證實產品對DPPH自由基、ABTS自由基均有一定的清除作用，具有較強的抗氧化活性，在一定濃度范圍內存在量效關系，但其機制仍需進一步研究。該研究為小米糠資源的深度開發提供了一定參考。