濃縮配制BPW增菌液對沙門氏菌檢測效果的影響

梁煜拓，韓佳憫，何嘉明，馬健聰

（佛山市食品藥品檢驗檢測中心，廣東佛山 528000）

沙門氏菌引起的中毒病例在世界各地的食物中毒病例中所占數量比例非常高[1-2]。資料統計顯示，我國70%～80%細菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起[3]。根據國家標準《預包裝食品中致病菌限量》 （GB 29921—2021），要求對易受沙門氏菌污染的食品進行分類管理，以使大多數食品不含沙門氏菌，從而有效地預防沙門氏菌食物中毒事件[4]。為此，各實驗室非常重視沙門氏菌的檢測工作，目前檢測方法有傳統分離鑒定法、免疫抗體法（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ，ELISA）、分子生物學法（Polymerase Chain Reaction，PCR）等。

由于食品在生產加工過程中，經過蒸煮、烘烤、腌制、冷凍和防腐等因素的作用，其中的沙門氏菌會受到非致命性損傷，在含量低且分布不均的情況下，很難直接從食品中檢測出來，極易出現假陰性漏檢情況。為防止帶有致病菌食品的漏檢，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，修復損傷菌并提高菌的數量后，再進行檢測就能有效地提高檢出率，因此不管是煩瑣的傳統分離法，還是快捷的免疫法、靈敏的PCR法中都缺少不了前增菌步驟。在《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》 （GB 4789.4—2016）中要求使用傳統分離法進行沙門氏菌檢驗：取25 g/mL樣品置于225 mL BPW中（36±1）℃培養8～18 h進行非選擇性前增菌后再經二次選擇性增菌，最后進行分離檢測[5]。因此，需要提前配制大量BPW增菌液并每份分裝225 mL，經121 ℃，15 min滅菌處理后備用，如先大量配制經滅菌后再分裝會導致因容量過大而造成滅菌不徹底，直接購買成品分裝好的增菌液則會增加成本，且量多時也不便放置冰箱冷藏保存。隨著我國與其他國家之間的國際貿易的不斷深入，我國的沙門氏菌限量標準也與國際標準進行了接軌。鐘立霞等通過對主要國際組織和貿易國家食品檢驗標準中沙門氏菌限量的比較，發現除美國外，其他國家和組織關于沙門氏菌限量標準均要求不得檢出，但采樣量卻各不相同，各個國家普遍的采樣件數n都大于或等于5，有的國家甚至達60[6]。我國國家標準也將以往要求的采樣件數n=1修改為n=5，在檢測程序不變的情況下，工作量相當于直接增至原來的5倍。另外，基于大多食品依據產品標準要求檢測致病菌沙門氏菌外，還需要檢測菌落總數、大腸菌群等衛生指標，然而在菌落總數、大腸菌群（n=5）等項目檢測時也需同樣取25 g/mL樣品于225 mL滅菌生理鹽水稀釋液中均質后，僅吸取幾毫升樣品液進行檢測，剩下的樣品液便丟棄。此時把濃縮配制的BPW增菌液直接加到剩下的樣品液中搖勻，進行沙門氏菌前增菌后再檢測，減少了重復取樣。在工作量大，且不能有效地提高自動化檢測程度時，通過合理地改良配制方法，既避免重復取樣工作，又便于增菌液配制、使用和保存，能有效減輕工作量，提高檢測效率，實用性意義顯著。

本文選擇4株沙門氏菌，包括1株標準菌株和3株常見的實驗室分離株[7-8]，按照GB 4789.4—2016對兩種不同配制方式的BPW增菌液進行均勻度、增菌效果、檢測靈敏度測試，以及在13類雜菌污染程度較高的預包裝食品中人工污染3種常見沙門氏菌分離株，比較其在不同的樣品環境和嚴重雜菌干擾影響下的檢測效果差異，評價BPW先濃縮配制后再添加使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胰蛋白胨大豆瓊 脂（Tryptone soya agar，TSA）、腦心浸萃液態培養基（Brain heart infusion medium，BHI）、緩沖蛋白胨 水（Buffer peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（Tetrathionate broth base，TTB），北京陸橋技術有限責任公司；沙門顯色培養基（科瑪嘉）、VIDAS SLM試劑盒，法國生物梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清，寧波天潤生物藥業有限公司。

常規BPW配制：按商品使用說明書把培養基按配方20 g/L比例稱取溶解均勻后分裝225 mL/瓶，經121 ℃，15 min滅菌后備用，每瓶含培養基成分4.5 g。

濃縮BPW配制：把培養基按45 g/100 mL的配方比例配制100 mL/瓶，121 ℃，15 min滅菌后備用，每瓶含培養基成分45 g（以下簡稱濃縮BPW）；使用時吸取10 mL濃縮BPW加入215 mL滅菌生理鹽水中稀釋均勻，得到225 mL增菌液，含培養基成分 4.5 g備用（以下簡稱SBPW）

mini-Vidas全自動免疫熒光分析儀，梅里埃公司。

1.2 試驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌標準菌株，CMCC(B)50115，中國醫學微生物菌種保藏管理中心；鼠傷寒沙門氏菌分離株、腸炎沙門氏菌分離株、德爾卑沙門氏菌分離株，由佛山市食品藥品檢驗檢測中心食品檢測中分離。

1.3 檢測樣品

經佛山市食品藥品檢驗檢測中心食品檢測后余樣，選取13個食品類別中雜菌含量較高的樣品代表各1份。具體樣品情況如表1所示。

表1 檢測樣品情況

1.4 方法

1.4.1 配制成分均勻度測試

（1）pH緩沖體系。取225 mL BPW和225mL SBPW分別倒入燒杯中，放置磁力攪拌器上，插入pH計，滴定1 mol/L NaOH，使pH計顯示8.0，記錄滴定量；再取225 mL BPW和225 mL SBPW分別倒入燒杯中，放置磁力攪拌器上，插入pH計，滴定 1 mol/L HCL，使pH計顯示6.0，記錄滴定量。平行測試2組，比較兩種增菌液對酸堿的緩沖能力。

（2）蛋白質含量。充分混勻BPW和SBPW，分別吸取10 mL至消化管中，再加入0.4 g CuSO4、6 g K2SO4及20 mL H2SO4于消化爐進行消化，取出冷卻后加入50 mL水，于自動凱氏定氮儀上自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據。平行測試4組，比較兩種增菌液主要蛋白質成分的配制均勻性差異。

1.4.2 增菌效果比較

將鼠傷寒沙門氏菌標準菌株接種到BHI肉湯培養過夜，進行10倍系列稀釋至10-7（菌落計數為 97 CFU/mL），分別吸1 mL加入100 mL BPW增菌液和100 mL SBPW增菌液中，于36 ℃培養箱培養，渦旋儀振蕩1 min充分均勻，取0 h 、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、24 h、36 h和48 h的培養物1 mL于平板中傾注TSA，36 ℃培養18 h，進行菌落計數。

1.4.3 檢測靈敏度比較

將鼠傷寒沙門氏菌標準菌株接種到BHI肉湯培養過夜，進行10倍系列稀釋至10-10菌液備用，取10-7、10-8、10-9、10-10菌液1 mL分別接種到225 mL BPW增菌液和225 mL SBPW增菌液中，每組稀釋度接種3個平行，36 ℃，18 h培養，接種1 mL于TTB增菌液中培養24 h后分離劃線于沙門氏菌顯色平板上進行培養，通過觀察顯色平板上的生長情況對檢測靈敏度作出評價。

1.4.4 人工污染樣品檢測比較

（1）菌液制備。將鼠傷寒沙門氏菌分離株、腸炎沙門氏菌分離株、德爾卑沙門氏菌分離株分別接種到BHI肉湯培養過夜，進行10倍梯度稀釋至10-8菌液備用，并同時各取1 mL備用菌液傾注TSA平板36 ℃培養，進行菌落計數，得到備用菌液的濃度分別為7 CFU/mL、3 CFU/mL、6 CFU/mL。

（2）樣品處理及增菌、快篩。分別取25 g/mL樣品于225 mL BPW和215 mL滅菌生理鹽水稀釋液中，用均質器均質1min，液體樣品振蕩混勻，往215 mL滅菌生理鹽水樣品液中加入10mL濃縮BPW混勻，再往樣品勻液中分別加入1 mL 鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌10-8備用菌液，具體添加情況如表2所示，另每組設置兩個樣品空白對照，一并于36 ℃前增菌培養18 h，各取1 mL增菌培養物于10 mL TTB培養基中，42 ℃二次增菌 24 h。同時取2 mL前增菌培養物于空試管中沸水浴5 min，進行mini-Vidas全自動免疫熒光分析儀快速篩選檢測。

表2 人工污染樣品檢測實驗組設置

（3）分離及鑒定。取二次增菌液分別劃線接種于沙門氏菌顯色平板中，36 ℃培養18 h，觀察平板上是否有紫紅色可疑菌落生長，將分離到的可疑沙門氏菌純化培養后，進行診斷血清凝集實驗，凝集A-F多價血清；如有O4、HI、H2凝集，鑒定為鼠傷寒沙門氏菌；O9、O12、Hg、Hm凝集，鑒定為腸炎型沙門氏菌；O4、Hf、Hg、H[1,2]凝集，鑒定為德爾卑沙門氏菌。比較相同增菌液不同配制使用方式對沙門氏菌檢測效果的影響。

2 結果與分析

2.1 兩種增菌液對酸堿的緩沖能力

由表3可知，兩種不同配制方式的增菌液對酸堿的緩沖能力沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表3 兩種增菌液對酸堿的緩沖能力

2.2 兩種增菌液蛋白質成分含量

由表4可知，在兩種不同配制方式的增菌液中主要營養成分蛋白質含量沒有顯著性差異 （P＞0.05）。

表4 增菌液中蛋白質成分含量（單位：g/100 mL）

2.3 沙門氏菌在兩種增菌液中的增菌效果

由圖1可知，兩種增菌液的生長曲線大致相同。沙門氏菌的數量隨時間延長不斷上升，0～4 h為調整期，6～16 h為對數增長期，18 h后進入穩定期。對數期細菌的數量增長最快，活力最好，最適宜進行接種培養實驗，符合《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）中規定的預增菌時間為8～18 h要求。

圖1 沙門氏菌標準株在兩種增菌液中的增菌效果

2.4 檢測敏感度結果

由表5可知，兩種增菌液對沙門氏菌最低檢出限均可達到10-9（1 CFU/225 mL），表明在檢測沙門氏菌時，SBPW增菌液的靈敏度與BPW增菌液的靈敏度相當。

表5 兩種增菌液對沙門氏菌標準株的最低檢出限

2.5 人工污染樣品結果

由表6、表7可知，在13個食品類別的樣品中分別少量污染3種常見沙門氏菌分離株，在不同樣品環境和雜菌干擾下，進行競爭性增菌、選擇性分離檢測，BPW增菌液和SBPW增菌液都能全部檢出目標沙門氏菌，檢測效果良好無差異性；但直接取18 h增菌培養物進行mini-Vidas快速篩選檢測，出現個別食品假陰性漏檢情況。

表6 兩種增菌液檢測沙門氏菌分離株人工污染樣品結果比較

表7 mini-Vidas快篩檢測假陰性漏檢情況

3 結論與討論

BPW緩沖蛋白胨水配方依據是ISO 6579，用在GB 4789.4—2016、SN 0170—1992、ISO 6579-1:2017等標準中作為沙門氏菌非選擇性的預增菌培養基。由于很多食品在加工過程中會對沙門氏菌細胞造成非致命性傷害，然而BPW的作用可以修復那些受損的沙門氏菌細胞，提高沙門氏菌的活力和含量；同時食品中的防腐劑也會對沙門氏菌檢測造成不利影響，BPW還具有稀釋毒性物質的作用。其成分中蛋白胨為細菌的生長提供氮源和碳源，能提供微生物生長所必需的核酸、蛋白質合成原料，是不可缺少的營養物質。磷酸鹽緩沖對可以維持pH穩定性，使多數細菌在合適pH=6.0～8.0的環境下利于生長繁殖。鑒于此培養基成分中蛋白胨和磷酸鹽緩沖對的重要性，如在配制過程中分裝不均勻導致營養不足，就會影響增菌效果，通過對兩種不同配制方式的BPW進行蛋白質含量和酸堿緩沖能力的測試，結果顯示無明顯的差異性，表明配制的均勻性良好，但SBPW在低溫冷藏下長期保存，底部會出現結晶現象，因此在使用前要先拿出放置室溫或熱水浴后充分搖蕩再使用，避免營養成分不均勻，影響增菌效果。通過增菌效果和檢測靈敏度比較，得出在兩種不同配制方式的BPW中沙門氏菌增菌生長曲線良好，均符合標準規定的預增菌時間在8～ 18 h內達到最佳生長狀態要求，且沙門氏菌最低檢出限均可達到10-9（1 CFU/225 mL）水平，檢測靈敏度較高。通過對多類食品人工污染少量沙門氏菌，在復雜的樣品環境條件和嚴重的雜菌干擾下（最高雜菌與沙門菌比例為105∶1），進行競爭性增菌培養，再選擇性分離檢測，實驗結果表明經過BPW和SBPW預增菌后都能完全檢測出目標沙門氏菌，沒有出現漏檢現象。但在兩種預增菌液中直接進行mini-Vidas快速篩選檢測，有個別食品出現假陰性情況，此類樣品經選擇性增菌后篩選檢測呈陽性。因此，在時間允許條件下，經選擇性增菌后再進行篩選檢測，能提高檢測效率。綜合實驗結果得出BPW先濃縮配制后再添加使用的方式可以應用于沙門氏菌日常檢測工作中，既方便配制、使用、儲存，又減輕了重復取樣的工作量，如能生產一次性濃縮BPW管，使用時直接添加使用，更能提高實驗室的工作效率。