COL5A2在胃癌組織中的表達及其與患者預后的關系

(青島大學附屬醫院消化內科，山東 青島 266003)

胃癌(GC)是全球五大常見惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的三大原因之一[1]。每年中國GC新發病例數達70萬，新增死亡病例數約50萬，平均每天有1 300多例GC患者死亡[2]。盡管目前GC的診斷和治療均取得了顯著成效，但大多數患者被發現時已是晚期或已發生轉移，GC患者的5年生存率仍不足10%[3]。因此，探索GC診斷和預后的精準生物標志物十分必要。

Ⅴ型膠原蛋白α2(COL5A2)屬于Ⅴ型膠原蛋白家族的一個亞型，是一種具有調節作用的纖維膠原，在原纖維的形成和腫瘤浸潤轉移的過程中起重要作用[4-6]。膠原蛋白超家族由28種不同類型的膠原組成，是細胞外基質的主要組成部分，占人體總蛋白的30%，對維持細胞正常的內穩態至關重要[7]。而細胞外基質是腫瘤微環境發生的關鍵，故近年來各類膠原蛋白在腫瘤中的作用受到了廣泛關注。研究顯示，COL5A2基因與膀胱癌、食管癌、結直腸癌以及胰管腺癌等的發生發展具有密切的關系[8-11]。WANG[12]利用芯片數據和網絡插件篩選與GC相關的差異表達基因，鑒定出COL5A2基因是GC中的一個關鍵基因。之后，WEI等[13]通過加權相關網絡和機器學習方法發現COL5A2基因是GC的不良預后因素。但上述相關研究只停留在基因網絡宏觀層面，沒有具體明確COL5A2基因在GC組織或細胞中的表達水平、突變情況以及可能參與的生物學過程。本研究通過對腫瘤芯片數據庫的挖掘和體外GC細胞功能實驗的研究，全面分析COL5A2基因在GC組織中的表達及其與患者預后的關系，探討COL5A2基因在GC中可能發揮的功能，并評估其作為GC診斷和預后生物標志物的潛力。

1 材料和方法

1.1 利用Oncomine數據庫分析COL5A2基因表達水平

登錄Oncomine數據庫(https://www.onco-mine.org/)[14]檢索COL5A2基因在不同腫瘤類型中的表達。數據設置的篩選條件如下:①基因為COL5A2；②數據比較類型為腫瘤組織與正常組織；③臨界值設定范圍為P<0.000 1,差異表達級別>2,基因排序為前10%。在以上條件的基礎上檢索COL5A2基因在GC中的表達，限定條件為：①腫瘤類型為GC；②數據類型為mRNA；③樣本類型為臨床標本。

1.2 利用cBioPortal數據庫分析GC中COL5A2基因的突變情況

在cBioPortal數據庫(https://www.cbioportal.org/)[15]當中，選擇“Stomach Adenocarcinoma(TCGA, Firehose Legancy)”數據集,選擇“帶有mRNA數據(RNA Seq V2)”的病例集，輸入基因名“COL5A2”，分析其在GC中的突變情況。在此基礎上點擊“Comparison/Survival”按鈕，在Survival板塊中生成COL5A2基因突變組與非突變組的生存曲線圖。

1.3 用Kaplan-Meier Plotter數據庫對COL5A2基因與GC患者預后的相關性進行分析

進入Kaplan-Meier Plotter平臺(https://kmplot.com/analysis/)[16]，在腫瘤類型中選擇“Gastric cancer”進行分析，生存條件限定為“overall survi-val”，檢索獲得COL5A2 mRNA與GC患者預后相關的生存曲線圖。

1.4 利用GEPIA數據庫驗證COL5A2 mRNA的表達及與患者預后關系

登錄GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)[17],點擊“Expression DIY”按鈕，進入“Boxplot”頁面，檢索COL5A2基因在GC組織中的表達水平，設置檢索條件為：①|log2FC|≥1,P<0.01；②正常數據的匹配為Match TCGA normal and GTEx data。此外，選擇“Stage plot”頁面，默認原始參數，檢索COL5A2基因在不同GC分期中的表達情況。而在“Survival Plots”頁面中，設置組內截斷值為“Median”，輸入腫瘤名稱“Stomach adenocarcinoma (STAD)”和基因名稱“COL5A2”，獲取患者生存曲線圖。

1.5 利用GeneMANIA數據庫繪制COL5A2基因互作網絡圖

在GeneMANIA數據庫(https://genemania.org/)[18]官網首頁中，輸入基因“COL5A2”，構建其相關基因網絡樹狀圖。之后通過Metascape在線網絡工具(http://metascape.org/gp/index.html)[19]，將COL5A2及其相關聯基因輸入，進行功能富集分析，限定條件為:①輸入物種為Any species；②分析物種為H. sapiens(20)。

1.6 細胞培養及GC細胞COL5A2 mRNA表達水平的檢測

正常人胃上皮細胞株GES-1以及GC細胞株HGC-27、MKN-45購自中國武漢普諾賽生命科技有限公司，GC細胞株BGC-823和SGC-7901獲贈自青島大學病原微生物研究中心。所有細胞均培養于含體積分數0.10胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的DMEM培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的濕化培養箱中常規培養。

采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測COL5A2 mRNA的表達水平。先利用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA，以總RNA為模板使用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA逆轉錄為cDNA，之后按照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)的說明書步驟配制相應體系來進行PCR擴增。所涉及的引物序列見表1。以GAPDH基因為內參對照，以2-△△CT測定目的基因mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR檢測COL5A2 mRNA表達水平所用引物序列

1.7 siRNA對HGC-27細胞的轉染以及轉染率的測定

將處于對數生長期的HGC-27細胞以同等密度接種于6孔板上，待孔內細胞融合為60%～70%時，使用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)進行轉染，使COL5A2基因在細胞中低表達。siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，具體序列見表2。將細胞分為陰性對照組(si-NC組)、轉染COL5A2-homo-4038 siRNA組(si-1轉染組)、轉染COL5A2-homo-3838 siRNA組(si-2轉染組)和轉染COL5A2-homo-4506 siRNA組(si-3轉染組)。siRNA和Lipofectamine 3000按1∶1比例加入完全培養基中，培養48 h后通過qRT-PCR 方法(檢測方法同1.6) 檢測各組細胞的COL5A2 mRNA的表達情況。

表2 細胞轉染所涉及的siRNA序列

1.8 CCK-8實驗檢測GC細胞的增殖能力

將處于對數生長期的HGC-27細胞制成單細胞懸液，按照2 000個/孔細胞密度接種于96孔板中并進行轉染。分別于轉染培養后0、24、48、72 h于每孔加入CCK-8試劑(上海碧云天生物技術有限公司)10 μL，置于恒溫細胞培養箱內孵育1.5 h，以酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度(A)值。

1.9 克隆形成實驗檢測GC細胞克隆形成能力

收集轉染48 h的HGC-27細胞制備成單細胞懸液，以1 000個/孔的細胞密度接種于6孔板中。置于恒溫培養箱中培養，每4～5 d更換完全培養基，待2周形成細胞克隆后終止培養。使用多聚甲醛溶液固定細胞30 min以后，用結晶紫溶液染色15 min，用PBS洗滌2～3次，晾干后計算細胞克隆數量。

1.10 統計學方法

2 結 果

2.1 GC組織樣本中COL5A2基因的表達情況

利用Oncomine數據庫在線分析COL5A2基因在多種類型腫瘤組織中的表達情況，結果顯示，涉及COL5A2基因的研究共417項，78項有統計學差異，在腫瘤組織中高表達75項，低表達3項。其中在GC中高表達的數據集有7項，包括5項mR-NA和2項DNA數據集。選擇Cui Gastric、Wang Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 5個mRNA數據集來確定COL5A2基因在GC中的表達情況,共涉及組織樣本478例。將數據集進行薈萃分析顯示，COL5A2 mRNA在GC差異表達基因的中位秩為105.00，P值為4.05×10-7，顯示COL5A2 mRNA在GC組織中呈高表達。以箱式圖對上述5項研究進行分析，結果顯示COL5A2基因在GC組織中的表達均明顯高于正常胃黏膜組織。見圖1。

2.2 COL5A2基因在GC組織的變異情況

在cBioPortal數據庫中一共訪問了415例GC樣本信息，其中43例發生COL5A2基因變異(突變率為10.36%)，包括擴增6例，深度缺失5例，截斷突變5例，錯義突變11例，信使RNA水平上調7例，信使RNA水平下調9例。比較COL5A2基因突變樣本與非突變樣本的生存差異，顯示COL5A2基因突變樣本患者比非突變樣本患者的總生存期(OS)更長。其中COL5A2基因突變組和非突變組的中位OS分別為57.39、26.45個月。見圖2A。

2.3 COL5A2基因與GC患者臨床預后的相關性

對Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，COL5A2 mRNA高表達的患者的OS明顯短于低表達的患者(HR=1.35，P<0.05)。其中COL5A2 mRNA高表達和低表達的中位OS分別為26.70、44.07個月。見圖2B。

2.4 COL5A2基因在GC組織中的表達及其與患者預后的關系

在GEPIA數據庫中對COL5A2基因在GC組織中的表達及其與GC患者預后的關系進行驗證，結果顯示，基于TCGA 和GTEx 數據集，COL5A2 mRNA在408例GC組織中的表達明顯高于211例正常胃黏膜組織；同時還發現COL5A2 mRNA表達水平與GC患者的分期有顯著關系，Ⅰ期胃癌患者COL5A2 mRNA表達水平比Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期GC患者表達低(F=2.65，P<0.05)。此外，GEPIA在線生存分析顯示，GC患者COL5A2 基因表達水平與OS有關(HR=1.5，P<0.05)。見圖2C。

2.5 COL5A2的關聯基因及其相關功能的預測

為了進一步研究COL5A2基因可能參與的生物學通路和功能，本研究利用GeneMANIA數據庫對COL5A2參與的基因互作調控網絡進行分析，結果以COL5A2基因為中心，呈扇形與多種基因互作展開，基因節點的大小表明了相互作用的強度，與COL5A2相互作用的基因互作的強度由強到弱分別包括COL5A1、BMP1、ITGA1、COL1A1、COL3A1、COL1A2、COL6A3、TGM2、POSTN、SPARC、FN1、FBXW11、GP6、COL11A1、COL4A2、LAMC1、LUM、THBS2、MXRA5、FAP。見圖3。隨后對其進行功能富集預測，結果顯示相關基因主要與整合素通路、細胞外基質受體交互、細胞基質黏附、骨骼系統開發、肽交聯、血管形態發生、細胞外基質分解及組織成形等有關。

圖1 Oncomine數據庫5個GC芯片的COL5A2基因表達柱狀圖

A：cBioPortal數據庫生存差異分析圖，B：Kaplan-Meier Plotter數據庫生存曲線圖，C：GEPIA數據庫生存曲線圖

圖3 GeneMANIA數據庫基因互作網絡圖

2.6 GC細胞系中COL5A2 mRNA的表達情況

qRT-PCR結果顯示，GES-1、HGC-27、MKN-45、BGC-823和SGC-7901中COL5A2 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、419.00±2.08、228.00±1.53、2.67±0.32、3.87±0.19，4種GC細胞株HGC-27、MKN-45、BGC-823和SGC-7901COL5A2 mRNA的表達水平均高于GES-1，差異具有統計學意義(F=253.40，P<0.05)，且在MKN-45和HGC-27細胞株中COL5A2 mRNA的表達量更高。因此，進行后續細胞功能實驗，可選用HGC-27或者MKN-45細胞株。

2.7 COL5A2 siRNA的轉染效率

將COL5A2 siRNA轉染HGC-27細胞，培養48 h后采用qRT-PCR技術檢測COL5A2基因干擾率。結果顯示，在HGC-27細胞中，si-1、si-2和si-3轉染組中COL5A2 mRNA的表達水平分別為0.23±0.04、0.38±0.05、0.82±0.04，明顯低于si-NC組(1.00±0.00)的表達水平，差異具有顯著性(F=93.06，P<0.05)，但si-1和si-2干擾效果更為顯著，因此，后續選用si-1和si-2進行細胞功能實驗。

2.8 下調COL5A2基因后HGC-27細胞的增殖活力情況

CCK-8實驗結果顯示，時間、分組以及時間與分組交互作用對HGC-27細胞增殖活力均有顯著的影響(F=4.50～223.60，P<0.05)。3組細胞轉染48、72 h時的增殖活力與轉染0、24 h比具有明顯差異(F=38.90～70.30，q=8.18～25.21，P<0.05)。而與相應的si-NC組比較，轉染72 h時，si-1和si-2組細胞增殖活力明顯降低，差異有統計學意義(F=21.29，q=8.58、9.87，P<0.05)；轉染0、24、48 h時，si-1和si-2組細胞增殖活力與相應的si-NC組比較無顯著差異。見表3。此外，細胞克隆實驗檢測結果顯示，si-1、si-2和si-NC組形成的克隆數量分別為61.33±6.89、72.33±8.35、114.00±9.54，si-1和si-2組形成的克隆數量明顯少于si-NC組，差異有統計學意義(F=11.12，P<0.05)。見圖4。

表3 不同轉染時間對HGC-27細胞增殖活力的影響

A：si-NC組，B：si-1轉染組，C：si-2轉染組

3 討 論

GC是一種發病率高、治療手段有限、臨床療效差的惡性腫瘤，開發新的生物標志物來預測GC患者的臨床預后非常重要。細胞外基質處于一種動態平衡狀態，通過調節纖維蛋白和各種膠原沉積而不斷重構，調控腫瘤形成過程中的各種細胞行為[20]。已被證實多種膠原蛋白與人類多種腫瘤的發生與發展密切相關，如Ⅴ型膠原蛋白家族成員COL5A2。COL5A2是細胞外基質中一個重要組成部分，與Ⅰ型膠原形成異型纖維，從而在腫瘤浸潤轉移的初始過程中發揮重要作用[4-5,21]。然而，目前比較缺乏COL5A2基因在GC中具體表達和作用的相關研究。因此，本研究基于數據庫挖掘探討COL5A2基因在GC中的作用，為后續預后生物標志物的篩選、靶向藥物的開發等提供一定的基礎。

COL5A2基因與人類多種類型腫瘤的發生發展密切相關。WU等[22]利用生物信息學方法發現COL5A2基因在正常結腸組織中不表達，但在結直腸癌腫瘤組織中表達；同時PATRA等[23]報道了COL5A2 mRNA在結直腸癌組織中高表達；以上結果均提示COL5A2基因在結直腸癌發生發展中發揮促癌作用。另一方面，有研究發現NKX2-2基因在骨肉瘤中可通過介導COL5A2基因導致轉錄下調，從而起到抑制腫瘤的作用[24]。在對卵巢癌細胞(SKOV-3)和卵巢表面上皮細胞來源的外泌體蛋白質和脂質體分析中發現，SKOV-3來源的外泌體中COL5A2蛋白顯著高表達，提示其在卵巢癌早期診斷中具有重要作用[25]。此外，COL5A2基因也可被視為腫瘤的生物標志物，與腫瘤患者的預后密不可分。ZENG等[26]研究報道COL5A2 mRNA在膀胱癌中高表達，與腫瘤侵襲性、T分期、N分期密切相關，并且COL5A2 mRNA高表達患者比低表達患者的臨床結局更差、生存率更低。同樣的，WENG等[27]研究發現COL5A2基因高表達的肺癌患者生存率低于低表達患者，認為COL5A2基因是肺癌患者的預后不良因素。值得注意的是，有研究發現在舌鱗狀細胞癌患者中，COL5A2基因高表達患者比低表達患者的無病生存期更長，認為COL5A2基因是舌鱗狀細胞癌預后有利因素[28]。因此，COL5A2基因在腫瘤中的作用是復雜的，在不同的癌癥中發揮著不同的作用，對于COL5A2基因與特定腫瘤的關系，應當特定研究。

隨著基因測序技術的發展，各種大規模的癌癥基因組項目收集了多維度的癌癥基因組學數據，這給癌癥基因組數據的研究、分析和整合提供了豐富的資源。Oncomine是世界上最大的癌基因芯片在線數據庫，包含全面癌癥微陣列信息，有利于發現新型腫瘤生物標記物或治療靶點[14]。cBioPortal是一個多維度分析癌癥基因組學數據的網絡資源，可視化呈現基因和癌癥樣本之間的遺傳變化[15]。Kaplan-Meier Plotter是一個包含基因表達數據和臨床數據的公共網絡平臺，可評估54 000個基因對包括GC在內的21種腫瘤預后的影響[16]。GEPIA數據庫整合了TCGA和GTEx數據，提供腫瘤樣本和正常樣本的RNA測序數據，對腫瘤相關聯的基因表達譜數據進行動態分析，從而深入挖掘新型腫瘤標記物[17]。

本研究基于對以上腫瘤芯片數據庫的挖掘，分析COL5A2基因在GC中的表達及其與GC患者臨床預后的關系。首先在Oncomine數據庫中本研究結果顯示COL5A2基因在GC組織中高表達；通過cBioPortal數據庫檢索到的415例GC樣本信息，表明COL5A2基因突變組比非突變組患者OS更長；在Kaplan-Meier Plotter平臺進行生存分析顯示，高表達COL5A2 mRNA的GC患者比低表達者預后更差。同時，GEPIA數據庫分析表明，COL5A2 mRNA不僅在GC組織中高表達，且還與GC患者的腫瘤分期相關。此外，GEPIA數據庫的生存分析也支持前序結果，表明高COL5A2 mRNA表達與GC患者的不良臨床預后顯著相關，提示COL5A2基因是GC預后的不利因素。之后，本研究同時在分子水平上進行了驗證，檢測不同類型GC細胞系中COL5A2 mRNA的表達情況，發現COL5A2在HGC-27以及MKN-45胃癌細胞株中呈顯著增高，與COL5A2 mRNA在GC組織中高表達的結果一致，因此，認為COL5A2基因在胃癌組織中發揮促癌基因的作用。

有關研究表明，COL5A2基因可能通過缺氧、凝血、根尖連接、血管生成和凋亡等途徑促進腫瘤的進展[25]。此外，MENG等[29]研究發現COL5A2基因與上皮間質轉化和細胞基質血管化高度相關，這些過程與癌癥的侵襲以及轉移均密切相關，推測COL5A2基因的表達可能與腫瘤侵襲密切相關。這在一定程度上解釋了COL5A2基因對腫瘤發生預測的能力。GeneMANIA是一個包含基因互作和潛在功能的平臺在線數據庫，而Metascape是一個提供全面的基因列表資源和分析的高效工具，通過以上2種數據庫，本研究評估了COL5A2密切關聯的基因，從而進一步分析其可能參與的生物學途徑與功能。首先，在分子水平上本研究發現COL5A2與COL5A1、MP1、ITGA1、COL1A1、COL3A1、COL1A2、COL6A3、TGM2、POSTN、SPARC、FN1、FBXW11、GP6、COL11A1、COL4A2、LAMC1、LUM、THBS2、MXRA5、FAP等基因互作調控，功能富集發現主要與整合素通路、細胞外基質受體交互、細胞基質黏附、骨骼系統開發、肽交聯、血管形態發生及組織成形等有關。在這基礎上，本研究還驗證了COL5A2基因對GC細胞增殖和克隆形成能力的確切作用。CCK-8和細胞克隆實驗表明，在HGC-27細胞下調COL5A2 mRNA表達后，細胞的增殖能力和克隆形成能力均明顯下降。本研究仍有尚未探索的方面，今后應進一步探尋COL5A2基因在GC中的關鍵信號通路和下游靶基因等。

綜上所述，COL5A2基因在GC組織和GC細胞中高表達，且與GC患者的腫瘤分期和不良預后密切相關，COL5A2基因突變患者預后相對較好，且COL5A2基因與細胞外基質受體交互、骨骼系統開發、肽交聯等有關，下調COL5A2基因的表達可抑制GC細胞的增殖和克隆形成能力。COL5A2基因在GC進展中起到重要作用，有望成為GC治療的潛在新靶點。