外泌體在腫瘤發生、發展及化療耐藥中作用的研究進展

(青島大學附屬醫院腫瘤內二科，山東 青島 260003)

外泌體是一種直徑為50～100 nm的膜性小泡[1]，其內部含有多種生物活性分子，例如蛋白質、mRNA、miRNA等[2]。外泌體最初在哺乳動物的成熟紅細胞中被發現，由細胞內的多泡體與細胞膜融合后分泌產生[3]。外泌體先是作為細胞廢物轉運體被人們所認識[4]。隨著研究的深入，發現外泌體可以參與細胞-細胞間的信息傳遞[3]，能通過將攜帶的遺傳信息傳遞給受體細胞，繼而對受體細胞的蛋白表達水平產生影響[5]。近期越來越多的研究表明,外泌體與腫瘤也有著密切的關系[6]。目前腫瘤化療的整體有效率較低，其中獲得性化療耐藥是影響治療效果的主要障礙[7]，而獲得性耐藥的主要機制包括：腫瘤細胞膜轉運蛋白過表達[8]、細胞解毒蛋白激活[9]、化療藥物活性的改變[10]、DNA修復分子的變化[11]、原癌基因激活以及抑癌基因失活[12]等。近幾年來研究發現外泌體能通過多種機制誘導腫瘤細胞對化療產生耐藥，如增加受體細胞耐藥相關蛋白的表達、介導藥物外排、抑制細胞凋亡等[13-14]。這提示我們可以針對外泌體的形成和釋放進行干預，為腫瘤的精準治療提供新的思路。

1 外泌體的合成、釋放與信息傳遞

人體內大多數細胞可以將雙層膜結合的納米囊泡釋放到細胞外。這些膜來源的囊泡(通常稱為胞外囊泡)根據其大小可以分為3種，外泌體(20～100 nm)、微泡(100～1 000 nm)和凋亡小體(1～5 μm)[15]。外泌體起源于細胞內的多泡體，多泡體為具有內吞作用的囊泡，與質膜融合后一部分被溶酶體降解，另一部分釋放到細胞外，成為外泌體[16]。經檢測發現，外泌體中含有多種生物分子，包括蛋白質及核酸等。不同來源的外泌體，其內容物有所不同[17]。到目前為止，已經在外泌體中發現了4 563種蛋白質、194種脂質、1 639種mRNA和764種miRNA[18]。作為細胞間信息傳遞的主要方式，外泌體與靶細胞間進行信息傳遞的方式主要包括3種。①外泌體膜蛋白與靶細胞膜蛋白相互作用從而激活細胞內的信號通路。外泌體上的纖連蛋白與骨髓瘤細胞上的硫酸乙酰肝素結合后激活p38和pERK信號通路，導致下游靶基因DKK1和MMP-9(促進骨髓瘤進展的兩種分子)的表達[19]。②外泌體可以將自身攜帶的遺傳物質轉移到靶細胞，使靶細胞表達相應的蛋白。來自小鼠肥大細胞外泌體的mRNA轉移至人肥大細胞后，在受體細胞中可發現新的小鼠蛋白質，表明外泌體轉移的mRNA在進入另一細胞后可被翻譯并表達[20]。③外泌體膜可以與靶細胞膜直接融合，將外泌體中攜帶的遺傳信息直接轉運到受體細胞[21-22]，載有螢光素酶表達基因的外泌體能直接通過質膜融合使靶細胞產生生物發光效應[23]。

2 外泌體與腫瘤的關系

癌細胞比健康細胞釋放更多的外泌體，其中主要原因為原癌基因的激活[24-25]，這提示著腫瘤與外泌體之間的潛在關系。外泌體通過與受體細胞對接并傳遞其所攜帶的蛋白質、DNA、mRNA和miRNA等內容物來調節腫瘤和宿主細胞的功能，并通過在腫瘤微環境及整個機體的傳遞來促進腫瘤的進展[25]。來源于腫瘤細胞的外泌體具有轉移miRNA和促血管生成的作用[26]。以上機制均表明外泌體有助于促進腫瘤細胞的發生與轉移。近來大量研究表明外泌體與腫瘤耐藥的發生密切相關，其可以通過傳遞耐藥性miRNA賦予敏感細胞耐藥性[27]，也可以通過將化療藥物包裝入外泌體而排出到細胞外來保護自身細胞免受化療藥物的細胞毒性作用[28]。

2.1 促進腫瘤的發生

腫瘤細胞來源的外泌體通過轉運miRNA以及致癌蛋白參與周圍細胞的惡性轉化。ELMAGEED等[29]研究證實，前列腺癌細胞分泌的外泌體通過轉運Ras轉錄物(H-ras和K-ras)、Rab蛋白(Rab1a、Rab1b、Rab11a)以及致癌miRNA(miR-125b、miR-130b和miR-155)等物質，使腫瘤抑制劑Lats2和PDCD4下調，從而誘導細胞發生間充質-上皮轉化，最終發展為前列腺癌細胞。缺氧及乙酰肝素酶刺激外泌體的分泌與乳腺癌的血管生成相關，并且是乳腺癌發生的主要原因之一[30-31]。腫瘤細胞的外泌體中含有pre-miRNA、Dicer、AGO2以及TRBP等物質，而CD43能特異性介導Dicer的累積。據報道，來自乳腺癌病人細胞的外泌體能以Dicer依賴的方式促進非致瘤性上皮細胞轉化為腫瘤細胞[6]。同時MELO等[6]證明，抑制腫瘤外泌體中Dicer的作用能明顯抑制受體細胞中的腫瘤生長，表明外泌體中的miRNA能促進腫瘤的形成與發展。另外，外泌體還能夠通過水平基因轉移，將致癌基因轉移到靶細胞而促進腫瘤的發生[32]。AL-NEDAWI等[33]的研究發現，含有EGFRvⅢ蛋白的外泌體能夠與缺乏EGFRvⅢ蛋白的癌細胞發生質膜融合，導致致癌活性改變，如轉化信號傳導途徑(MAPK和Akt)的激活，EGFRvⅢ蛋白調節基因(VEGF、Bcl-x(L)、p27)的表達改變。例如含有突變KRAS等位基因的結腸癌細胞能夠通過分泌外泌體將KRAS突變蛋白轉移到KRAS野生型的結腸癌細胞中，從而促進細胞的增殖[34]。以上結果表明，腫瘤細胞衍生的外泌體能在腫瘤發生期間進行細胞間的信息傳遞。

2.2 促進腫瘤侵襲和轉移

MET蛋白是促進腫瘤細胞增殖、運動和遷移的致癌性受體酪氨酸激酶，常在腫瘤細胞中被異常激活[35]。最新研究證實，黑色素瘤來源的外泌體能夠在腫瘤轉移中發揮作用。晚期黑色素瘤病人外泌體中的MET蛋白增加，并證明黑色素瘤來源的外泌體通過形成轉移前微環境及血管生成的增加促進骨髓來源細胞發生轉移[36]。據報道，來自成纖維細胞的外泌體在乳腺癌細胞的遷移中起重要作用，成纖維細胞來源的外泌體通過激活Wnt-PCP信號途徑促進乳腺癌細胞的侵襲行為[37]。另外，外泌體可以通過血液循環進行全身性傳播，并且可以對轉運的RNA起保護作用，使其能夠作用到遠端靶細胞。高度轉移的癌細胞能夠通過分泌外泌體使受體細胞形成轉移前微環境，進而增加腫瘤的轉移能力。在癌癥研究中發現，隨著腫瘤向更具有侵襲性的表型轉化，外泌體的分泌常常增加。DEMORY等[34]研究顯示，乙酰肝素酶能通過改變外泌體攜帶的蛋白組合物，如增加syndecan-1、VEGF和HGF(3種與侵襲性腫瘤表型相關的蛋白)的表達，而增加腫瘤的侵襲性。乙酰肝素酶能通過上調MMP9表達水平以及降解多配體聚糖-1中硫酸乙酰肝素鏈的長度促使多配體聚糖-1從腫瘤細胞表面上脫落，暴露出VLA-4和VEGFR2的結合位點，激活VEGFR2信號傳導通路，從而促進血管生成和腫瘤轉移。同時纖連蛋白介導的外泌體與骨髓瘤細胞的結合能激活p38以及pERK的信號傳導，并激活下游的靶基因DKK1和MMP-9(促進骨髓瘤進展的兩種分子)的表達[19]。來自腎癌細胞的CD105陽性的外泌體可以通過上調MMP2、MMP9和VEGFR1，在SCID小鼠肺細胞中形成轉移前位，提示腎癌細胞來源的外泌體能夠促進腫瘤的肺轉移[38]。另外，腫瘤來源的外泌體還可以通過觸發免疫抑制反應來調節免疫系統，這也有利于腫瘤進展[39]。在肺癌細胞釋放的外泌體中，miRNA可使巨噬細胞中與Toll樣受體(TLR)家族相關的轉錄物沉默，這種機制有利于刺激巨噬細胞分泌促炎細胞因子，增加腫瘤細胞的侵襲性[40]。

2.3 促進腫瘤耐藥

目前認為腫瘤耐藥的產生是一個多因素過程，包括藥物外流增加、藥物失活、藥物靶點改變以及細胞凋亡的抑制等[41]。外泌體在癌細胞之間傳遞蛋白質及miRNA而產生化療耐藥[42]，并且發現其主要通過以下4個方面介導耐藥產生：①增加化療藥物的外排，或將藥物包裹以保護自身免受細胞毒性損害。細胞膜上的轉運蛋白可以介導化療藥物排出細胞外，而藥物外流的增加主要與ABC轉運蛋白(如P-gp)以及多藥耐藥蛋白的表達上調有關[43]。LV等[44]研究發現，化療耐藥的乳腺癌細胞能通過外泌體將P-gp傳遞給敏感細胞，從而使敏感細胞發生化療耐藥。同時在前列腺癌研究中發現，通過外泌體轉移多藥耐藥蛋白-1(MDR-1/ P-gp)可以使前列腺癌細胞產生對多西他賽的耐藥性[42]。②通過自身攜帶的蛋白質或核酸誘導受體細胞產生耐藥。腫瘤來源的外泌體具有水平轉移耐藥的能力，可以將耐藥性傳遞給敏感細胞，從而產生新的耐藥細胞。當將某些來自乳腺癌耐藥細胞的外泌體中的miRNA(miR-100、miR-222、miR-30a以及miR-17)轉移至敏感細胞時，可以賦予敏感細胞耐藥性。而腫瘤的耐藥性部分歸因于腫瘤源性的外泌體傳遞的miRNA種類。阿霉素耐藥的乳腺癌細胞通過分泌攜帶與Wnt信號通路相關miRNA的外泌體，激活Wnt信號通路，從而增強靶細胞的致瘤性及化療抵抗[27]。③通過免疫逃逸避免細胞毒性藥物的損害。有報道顯示腫瘤源性外泌體攜帶的TGF-β能改變細胞對IL-2的反應，使其逃脫免疫系統監管及細胞毒性藥物殺傷作用[45]。細胞內過量補體可以使細胞膜溶解，導致細胞死亡。而PILZER等[46]發現外泌體攜帶的mortalin/GRP75蛋白，可以促進自身載有補體MAC的外泌體脫落，并保護細胞免于補體介導的裂解，而產生化療耐藥。淋巴瘤來源的外泌體含有CD20，并且可以與治療性的抗CD20抗體結合，從而保護靶細胞免受抗體損害，增加治療抗性。④外泌體還可以通過增強自噬及抑制凋亡的途徑誘導靶細胞產生化療耐藥。如前所述，乙酰肝素酶在骨髓瘤組織中表達上調。研究發現當敲除小鼠細胞中的乙酰肝素酶后，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達下降。經抗腫瘤治療后外泌體內的乙酰肝素酶增多，通過外泌體轉移至靶細胞并使靶細胞的自噬增強，可以促進腫瘤生長和化療耐藥[47]。類風濕關節炎產生的外泌體被抗CD3激活的T細胞有效攝取后，可以激活AKT和NF-κB，并且使這些激活的T細胞對細胞凋亡具有抗性，從而抑制細胞凋亡而增加治療耐藥。

胃癌是世界上第四大常見惡性腫瘤，在腫瘤相關性死因中排第二位[48]。因為胃癌的早期癥狀不明顯，早期檢出率低，導致其在發現時一般為晚期。因此化療是胃癌治療的主要手段。氟尿嘧啶類、鉑類及紫杉類藥物是胃癌化療的基礎用藥，而這些藥物的耐藥問題尤為突出。研究證實，多種細胞釋放的外泌體及腫瘤微環境中外泌體的傳遞可以參與調控胃癌細胞的耐藥。腫瘤源性的外泌體能穩定攜帶miRNA并轉移到靶細胞中，使靶細胞中多藥耐藥相關蛋白的表達增加。JI等[13]證實，間充質干細胞(MSCs)來源的外泌體與受體細胞結合后能夠激活GaM-K，從而觸發下游的Raf/MEK/ERK級聯蛋白，使多藥耐藥蛋白(MDR、MRP、LRP)上調，從而引起胃癌細胞對5-FU的化療耐藥。并且MSCs來源的外泌體還可以攜帶P-gp/MDR蛋白，促進化療藥物的外流增加。已經證實在多種類型的癌癥中miR-21的上調與上皮-間充質轉化(EMT)增加呈正相關。ZHENG等[14]發現，外泌體中的miR-21可以直接從巨噬細胞轉移到胃癌細胞中，并通過下調PTNE抑制細胞凋亡，增強PI3K/AKT信號通路的活化，最終導致胃癌細胞對DDP的耐藥。

3 結語

盡管外泌體在腫瘤相關領域的研究已經開展，也證實其在腫瘤的發生、發展、耐藥等方面發揮重要作用，但是我們需要更詳細的分子機制來明確它們的內在聯系。已經有研究表明外泌體在乳腺癌、非小細胞肺癌和前列腺癌的化療耐藥方面起著重要作用。但在胃癌耐藥方面，由于相關研究較少，還需要更多的理論數據來支持這一觀點。總體來說，外泌體對腫瘤起促進作用，如果針對外泌體的產生和釋放進行調節，不僅為提高腫瘤的化療療效提供了新靶點，也為腫瘤精準治療的發展提供了新思路。