miR-103a-3p對肝細胞癌細胞遷移能力的影響及其作用機制

(青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，山東 青島 266071)

肝細胞癌(HCC)是臨床最常見的致死性惡性腫瘤[1-2]，首選治療方法仍然以手術切除為主，但由于HCC具有侵襲性強、肝內轉移等特點，其術后高復發率嚴重影響患者預后[3-5]。近年來，HCC分子靶向藥物治療取得顯著進展，但是靶向藥物治療帶來的不良反應也不容忽視，嚴重影響了患者的依從性和療效[6-8]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類由18～25個核苷酸組成的微小的非編碼單鏈RNA分子，能夠通過堿基配對在轉錄后水平上通過降解mRNA或者阻止mRNA翻譯來沉默mRNA，發揮其基因調控作用[9-10]。miR-103作為miRNAs家族中的一員，包括miR-103-1和miR-103-2兩種類型，miR-103a-3p是miR-103-1中常見的一種亞型。近年來研究發現，miR-103在多種組織中呈異常表達，其與腫瘤的發生發展密切相關[11]。在結直腸癌中，miR-103通過靶向死亡相關蛋白激酶(DAPK)和Krüppel樣因子4(KLF4)促進結直腸癌的轉移，miR-103還可靶向下調E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)促進結直腸癌的侵襲[12]。在胃癌中，miR-103a-3p通過靶向轉錄激活因子7(ATF7)促進人胃癌細胞增殖[13]。提示miR-103可以作為潛在的生物標志物用于癌癥的診斷和治療。

內質網跨膜蛋白166(TMEM166)基因，又稱作FAM176A或者EVA1A，是2007年鑒定出來的一種參與細胞自噬與凋亡的基因[14]。研究發現，TMEM166在HCC中能夠被miR-125b靶向下調，從而可以增加HCC細胞對化療藥物奧沙利鉑的敏感性[15],提示TMEM166在HCC中低表達可能是受到了miRNAs的靶向調控。但是miR-103a-3p對TMEM166是否存在靶向調節以及是否通過TMEM166調控HCC細胞的遷移，目前尚不清楚。本研究擬探討miR-103a-3p對HCC細胞遷移的影響及其作用機制，為進一步尋找HCC的診斷和治療靶點奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常肝細胞L02、人HCC細胞系Hccl-M3與293T細胞來自于青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學實驗室。

1.2試劑

DMEM/HIGH GLUCOSE培養基(美國HyClone公司)，青鏈霉素混合液(美國sigma公司)、RIPA蛋白提取試劑盒(中國賽默飛世爾科技有限公司)，Trizol RNA提取試劑(日本TaKaRa公司)，miR-103a-3p mimics、miR-103a-3p inhibitor以及其陰性對照NC(上海漢恒生物科技有限公司)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)，兔抗人TMEM166多克隆抗體(英國Abcam公司)，RT-PCR試劑盒、RNA反轉錄試劑盒(南京諾唯贊公司)，TMEM166引物(北京擎科新業生物公司)。

1.3 細胞培養

將人正常肝細胞L02、HCC細胞系Hccl-M3接種于含體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的細胞培養箱內，培養至合適密度后用于后續處理。

1.4 研究方法

1.4.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測正常肝細胞L02和HCC細胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表達水平 采用Trizol法提取常規培養的細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以此為模板進行RT-qPCR。根據試劑盒說明書配制反應體系，以U6作為內參照，每個樣品設3個復孔。實驗重復3次。采用2-△△CT計算樣本中miR-103a-3p mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.2Western blot方法檢測細胞中TMEM166蛋白的相對表達量 取對數生長期的Hccl-M3細胞，以每孔約5×105個細胞數接種于6孔板中，待細胞融合度為40%左右，將細胞按照實驗要求分為A、B、C、D組，各組分別轉染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor，轉染72 h后，棄掉培養基，用PBS洗滌2次，按照PMSF∶RIPA=1∶100的比例配置蛋白裂解液，提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后高溫加熱使蛋白變性。按照SDS-PAGE凝膠制備說明書配置150 g/L的分離膠及50 g/L的濃縮膠，電泳、轉膜，然后以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)室溫孵育2.5 h，以β-actin作為內參。TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育1 h，重復上述洗膜步驟，顯影，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值計算，結果取3次重復實驗的均值。

1.4.3雙熒光素酶報告基因活性的檢測與分析構建TMEM166野生型3′-UTR(TMEM166-3UTR-wt)和突變型3′-UTR(TMEM166-3UTR-mu)熒光素酶報告基因質粒，將293T細胞分為F、G、H以及I組，各組分別轉染mimics NC與TMEM166-3UTR-wt、miR-103a-3p mimics與TMEM166-3UTR-wt、mimics NC與TMEM166-3UTR-mu、miR-103a-3p mimics與TMEM166-3UTR-mu，轉染48 h后，棄掉培養基后，用PBS洗滌3次；向每個樣品孔中加入100 μL Passive Lysis Buffer，充分裂解細胞15 min，將細胞裂解液轉移至1.5 mL EP管中，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取上清液；向96孔黑色酶標板中每孔加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ工作液，再向每孔加入20 μL細胞裂解液，吹打混勻后測定記錄Firefly luciferase值(內參值)；向每孔中加入100 μL 終止液，吹打混勻后檢測記錄Renilla luciferase值(報告基因發光值)。相對熒光素酶活性以報告基因發光值/內參值表示。結果取3次重復實驗的均值。

1.4.4細胞劃痕實驗檢測HCC細胞系Hccl-M3的遷移能力 取對數生長期的Hccl-M3細胞，以每孔約5×105個細胞數接種于6孔板中，待細胞匯合度達到40%～60%時，將細胞按實驗要求分為A、B、C、D、E組，各組分別轉染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor、miR-103a-3p mimics與TMEM166-Myc，轉染嚴格按照說明書操作。轉染后的細胞繼續培養至細胞密度達到95%時進行劃痕，于劃痕后0、48 h在顯微鏡下觀察并拍照，應用Image J軟件計算劃痕面積，結果取3次重復實驗的均值。

1.4.5統計學方法 采用Graphpad Prism 6.0進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 正常肝細胞L02和HCC細胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表達水平

RT-qPCR檢測結果顯示，正常肝細胞L02和HCC細胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA平均相對表達量分別為1.08±0.12、5.07±0.27，兩者比較差異具有顯著性(t=13.49，P<0.05)。

2.2 miR-103a-3p對Hccl-M3細胞TMEM166蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，A～D組Hccl-M3細胞中TMEM166蛋白的相對表達量分別為0.56±0.01、0.22±0.00、0.51±0.01、0.73±0.00，組間比較差異有顯著性(F=276.20，P<0.05)；與A組相比，B組細胞中的TMEM166蛋白相對表達量明顯降低(t=22.33，P<0.05)；與C組相比較，D組細胞中TMEM166蛋白相對表達量明顯升高(t=9.72，P<0.05)。見圖1。

2.3 miR-103a-3p與TMEM166的結合位點預測

通過starBase軟件預測發現，miR-103a-3p與TMEM166存在結合位點(圖2)。

A、B、C、D分別對應A、B、C、D組

圖2 starBase軟件預測 miR-103a-3p與TMEM166-3′UTR的結合位點

2.4 雙熒光素酶活性分析結果

熒光素酶活性檢測結果顯示，F～I組熒光素酶的活性分別為0.99±0.02、0.56±0.02、0.98±0.02、0.96±0.02，組間比較差異具有顯著性(F=122.90，P<0.05)；與F組相比，G組熒光素酶活性明顯降低(t=23.17，P<0.05)，說明突變成功，結合位點預測正確，TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因。

2.5 miR-103a-3p表達對Hccl-M3細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果表明，A～E組細胞遷移率分別為0.38±0.01、0.46±0.00、0.39±0.01、0.34±0.00、0.41±0.01，組間比較差異有顯著性(F=16.83，P<0.05)；與A組相比，B組細胞的遷移能力明顯升高(t=4.13，P<0.05)；與C組相比，D組細胞的遷移能力降低(t=4.33，P<0.05)；與B組相比，E組細胞的遷移能力降低(t=4.91，P<0.05)。見圖3。

A、B、C、D、E分別對應A、B、C、D、E組

3 討 論

HCC是世界范圍內癌癥相關死亡的第3大原因[1]。目前HCC的治療很大程度上依賴于靶向治療，它能夠特異地作用于腫瘤發生發展過程中起關鍵作用的靶分子及其調控的信號通路達到治療腫瘤的目的[16-17]。近年來隨著對HCC致病機制的深入研究發現，microRNA在HCC組織中表達異常，廣泛參與HCC的發生發展過程，對HCC增殖、凋亡及轉移有重要的調節作用，成為HCC診斷、治療以及患者預后的重要靶點[18-20]。目前，HCC的發生發展機制尚不完全清楚，因此，探索其發生發展的分子機制對于尋求HCC診斷、治療的新靶點極為重要。

miR-103與人類多種惡性腫瘤密切相關，其在多種組織中表達異常發揮抑癌或促癌作用。在非小細胞肺癌中，miR-103通過直接靶向程序性細胞死亡因子10(PDCD10)發揮抑癌作用[21]；在神經母細胞瘤、胃癌、乳腺癌、結直腸癌和膀胱癌中，miR-103通過靶向調控特定的基因發揮促癌作用[22-26]。在本研究中，首先鑒定了miR-103在HCC中的表達情況，再進一步研究其對HCC細胞遷移能力的影響。RT-qPCR結果顯示，HCC細胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA水平顯著高于正常肝細胞L02。細胞劃痕實驗結果顯示，上調miR-103a-3p表達后，Hccl-M3細胞遷移能力明顯提高，說明miR-103a-3p表達可促進人HCC細胞遷移。為了探討miR-103a-3p調控細胞遷移的分子機制，本研究采用軟件預測并通過雙熒光素酶實驗證實，TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因,進一步通過共表達miR-103a-3p和TMEM166，發現TMEM166的表達能夠顯著減弱miR-103a-3p對HCC細胞的促遷移作用，表明miR-103a-3p促進HCC細胞遷移可能是通過靶向下調TMEM166的表達實現的。

TMEM166是位于人2號染色體短臂12區的一種新型內質網和溶酶體相關蛋白。研究發現，與正常組織相比，TMEM16在肝癌、胰腺腫瘤、食管鱗狀細胞癌等人類腫瘤組織中顯著下調[27-29]，提示其可能參與了這些腫瘤的發生或發展。研究表明，過表達TMEM166能夠通過誘導宮頸癌HeLa細胞、非小細胞肺癌H1299細胞、膠質母細胞瘤SHG44等的凋亡來抑制腫瘤細胞增殖[30-31]。最新一項研究表明，TMEM166能夠通過上調TP53誘導細胞凋亡來抑制肝癌細胞的侵襲、遷移和增殖[27]。另有研究發現，TMEM166能夠被miR-125b靶向下調從而可以增加HCC細胞的化療敏感性[15]，提示在肝癌中，TMEM166的下調可能受某些miRNAs調控。本研究通過雙熒光素酶報告基因方法證明了miR-103a-3p對于TMEM166存在靶向調控作用。并采用Western blot方法檢測miR-103a-3p對于TMEM166表達的影響，結果表明，過表達miR-103a-3p能夠下調TMEM166蛋白的表達，驗證了miR-103a-3p對TMEM166的靶向調控作用。目前關于miR-103a-3p以及TMEM166在HCC中的研究較少，本研究通過雙熒光素酶報告基因的方法,首次驗證了miR-103a-3p與TMEM166的靶向調控關系，并且初步證實miR-103a-3p可以通過抑制TMEM166基因的表達促進HCC細胞遷移。

上皮間質轉化(EMT)對腫瘤進展過程中細胞遷移至關重要。研究發現，在口腔鱗狀細胞癌中，miR-103通過靶向調控婆羅雙樹樣基因4(SALL4)的表達調控EMT[32]。在HCC中，miR-103是否通過靶向TMEM166參與EMT的調控還有待進一步研究證實。XIA等[33]研究顯示，miR-103能夠通過靶向A型激酶錨定蛋白12(AKAP12)促進HCC細胞的生長，但具體的作用機制以及該靶向調控是否與促進HCC細胞遷移有關尚不清楚。以上分析表明，除TMEM166以外，miR-103還可能通過其他靶標促進HCC細胞的遷移，因此，miR-103對HCC進展的確切機制還需要進一步研究。此外目前還有研究發現，在三陰性乳腺癌中，長鏈非編碼RNA MIR503HG通過調控miR-103/OLFM4的表達調控細胞遷移和侵襲[34]，HCC中是否也存在長鏈非編碼RNA對miR-103調控，也有待于進一步研究。

綜上所述，本研究首次證實了miR-103a-3p通過對TMEM166基因的靶向調控作用來促進HCC細胞遷移。但miR-103a-3p靶向調控TMEM166基因發揮促癌作用的具體機制還需要進一步研究，以進一步揭示HCC可能的發生發展機制，為HCC診斷以及治療新靶點的選擇提供理論支持。