EZH2、IMP3、Glut1蛋白在惡性間皮瘤組織中的表達及意義

(1 青島大學基礎醫學院病理學系，山東 青島 266003； 2 單縣中心醫院病理科； 3 青島大學附屬醫院病理科)

惡性間皮瘤(MM)是一種罕見的間皮源性惡性腫瘤，因組織形態多樣，其診斷及與轉移性腺癌、反應性間皮細胞增生(RMH)的鑒別診斷存在困難，尤其與RMH的鑒別更是一個挑戰。目前用于兩者輔助鑒別診斷的免疫組織化學抗體對其診斷特異度及靈敏度均不高[1]。zeste基因增強子人類同源物 2(EZH2)是新發現的具有組蛋白甲基轉移酶活性的腫瘤相關蛋白，參與細胞的周期調控、衰老、分化以及腫瘤發生等病理生理過程，該蛋白的異常表達可促進腫瘤的發展和轉移[2-3]。胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結合蛋白3(IMP3)作為一種新識別的mRNA結合蛋白，參與調節胰島素樣生長因子Ⅱ的轉錄，影響胚胎組織增殖，其高表達與多種惡性腫瘤患者預后不良相關，而陰性或弱表達被認為是良性或低級別病變[4-6]。臨床研究發現，葡萄糖轉運蛋白1(Glut1)作為哺乳動物細胞葡萄糖轉運的主要載體，為腫瘤細胞攝取葡萄糖提供跨膜轉運，其在腫瘤細胞中表達的強弱或與腫瘤的惡性程度相關[7-8]。為驗證上述論斷，本文采用免疫組化方法檢測EZH2、IMP3、Glut1蛋白在MM和RMH組織中的表達狀況，探討其在MM的診斷及預后判斷中的意義。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集單縣中心醫院2013-2018年經病理診斷為MM的蠟塊標本50例，診斷和分類均按照《惡性間皮瘤病理診斷指南》[9]標準執行。所有病例均由兩位經驗豐富的高年資診斷醫師雙盲法閱片復診。本組病例男17例，女33例；年齡39～76歲，平均60歲；發生于胸膜18例，腹膜 32例；組織學形態呈上皮型29例，肉瘤型10例，雙相型11例；40例患者有石棉接觸史。所有患者術前均未行放化療或免疫治療。同時選取20例RMH樣本作為對照組，其中男13例，女7例；年齡42～74歲，平均59歲。

1.2 主要試劑

兔多克隆抗體EZH2購自英國Abcam公司，兔抗人IMP3單克隆抗體(克隆號EP286)、鼠抗人Glut1單克隆抗體(克隆號SPM498)及二抗試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 研究方法及判定標準

所有標本經石蠟包埋，常規4 μm厚切片，分別行HE染色和免疫組織化學SP法染色。以PBS液替代一抗作為陰性對照，用已知的EZH2陽性的乳腺癌組織、IMP3陽性的胰腺癌組織及Glut1陽性的胎盤組織作為陽性對照。綜合分析每張切片中細胞的染色強度及陽性細胞百分比，對染色強度及陽性細胞百分比評分，兩項指標分數乘積>3分為陽性表達[10]。

1.4 隨訪

通過電話聯系及調閱電子病歷進行隨訪，隨訪截至2020年5月，患者生存期從最初診斷截至死亡，以月為單位計算。

2 結 果

2.1 EZH2、IMP3、Glut1在MM及RMH組織中的表達情況

EZH2陽性表達定位于細胞核中，部分伴細胞質著色，以淋巴細胞作為陽性內對照，50例MM中(圖1A～C)陽性表達率為88%，20例RMH中(圖1D)陽性表達率為10%，EZH2在MM與RMH組織中的表達差異有顯著性(χ2=35.19，P<0.05)。IMP3定位于細胞膜及細胞質中，以淋巴細胞作為陽性內對照，50例MM中(圖1E～G)陽性表達率為60%，而20例RMH中(圖1H)陽性表達率為5%，IMP3在MM與RMH中的表達差異具有顯著意義(χ2=15.36，P<0.05)。Glut1定位于細胞膜，以組織內紅細胞作為陽性內對照，Glut1在50例MM中(圖1I～K)陽性表達率為68%，20例RMH(圖1L)中均未見陽性表達，Glut1在MM與RMH組織中的表達差異有顯著性(χ2=26.46，P<0.05)。

2.2 EZH2、IMP3、Glut1及聯合檢測對MM診斷的價值

研究結果示，EZH2并IMP3、EZH2并Glut1、IMP3并Glut1、EZH2并IMP3并Glut1對MM診斷的靈敏度分別為90%、98%、84%、98%。其他見表1。

表1 EZH2、IMP3、Glut1聯合檢測對MM診斷的價值

2.3 EZH2、IMP3、Glut1表達與MM患者臨床病理學特征的關系

IMP3表達與MM患者發病部位有關(χ2=5.22，P<0.05)，而與其他各項臨床病理參數無關(P>0.05)；EZH2、Glut1表達與MM患者臨床病理學參數無關(P>0.05)。見表2。

2.4 EZH2、IMP3、Glut1表達與MM患者預后的關系

本組50例MM患者隨訪資料完整，隨訪率100%。截至隨訪，50例患者均死于該疾病。1年總生存率為26%，兩年總生存率為2%。IMP3陽性表達的患者平均生存時間為9個月，1年總生存率為20%，陰性表達者平均生存時間為12個月，1年總生存率為50%，IMP3陽性表達者生存率較陰性表達者顯著降低，差異有顯著意義(χ2=10.35，P<0.05)；EZH2及Glut1陽性表達者與陰性表達者生存率比較差異均無顯著性(P>0.05)。

A～C：EZH2在上皮樣、肉瘤樣及雙相型MM組織中均陽性表達；D：EZH2在RMH組織中失表達；E～G：IMP3在上皮樣、肉瘤樣及雙相型MM組織中均陽性表達；H：IMP3在RMH組織中失表達；I～K：Glut1在上皮樣、肉瘤樣及雙相型MM組織中均陽性表達；L：Glut1在RMH組織中失表達。SP法，100倍

表2 EZH2、IMP3、Glut1表達與MM患者臨床病理特征的關系

3 討 論

MM是源于漿膜腔被覆的間皮細胞的惡性腫瘤，其形態學復雜，需要與RMH、轉移癌等多種良惡性病變進行鑒別診斷，盡管RMH與MM在大部分情況下區別是明顯的，但是在穿刺活檢組織較少或組織學不典型的情況下，單從形態上很難區分是增生還是腫瘤，因此除常規形態學特征外，聯合應用多種生物標記可用于兩者的診斷和鑒別診斷[11-14]。有研究認為Desmin和EMA是最常應用的免疫標記物[15]，然而，這些標記物對MM診斷的靈敏度與特異度均低于90%，在日常臨床實踐中作用有限。最近，有研究提示EZH2、IMP3及Glut1在MM中過表達，而在RMH中低表達或不表達，因此，預測它們在臨床病理診斷上可能具有一定的應用價值，為了驗證這一推測，本研究對50例MM中EZH2、IMP3及Glut1的表達及其意義進行了初步探索。

EZH2是PcG基因家族的核心成員，在表觀遺傳沉默以及細胞周期中發揮著重要作用。EZH2通過靶向催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27m3)從而沉默與細胞分化、抑制增殖在內的基因，導致腫瘤的發生[16-17]，并與腫瘤的惡性進展、侵襲性及轉移能力關系密切[18]。目前，已在多種惡性腫瘤中證實EZH2蛋白過表達，而在對應的正常組織中不表達或低表達[19-20]。此外，過表達與腫瘤的增殖和患者的預后差密切相關[21]。高勝男等[22]研究了67例MM中EZH2的表達情況，結果顯示診斷的靈敏度為77.6%。有研究顯示EZH2高表達對MM診斷具有比較高的特異度，可與RMH進行鑒別[23]。本研究中EZH2診斷MM的靈敏度為88%，特異度為90%，在MM中陽性表達率顯著高于RMH，提示EZH2在MM與RMH的鑒別診斷中有一定的應用價值。

IMP3是胰島素樣因子RNA結合蛋白家族中的一員，調節胰島素樣生長因子Ⅱ轉錄，在胚胎發生早期的RNA定位和穩定以及細胞生長中起著重要的作用[24]。IMP3也是癌胚蛋白，有研究報道其表達與多種惡性腫瘤相關，如胰腺癌、腎癌、肺癌及胃癌等，而在正常細胞、反應性增生細胞和良性腫瘤細胞中通常呈陰性表達[25-26]，表明IMP3是區分惡性腫瘤與良性病變的重要生物標記物。有研究應用免疫組化法檢測45例MM中IMP3的表達，結果顯示33(73%)例呈陽性表達，而64例RMH中均無表達[27]。本研究50例MM中有30例呈陽性表達(60%)，20例RMH中僅1例呈陽性表達(5%)，本研究結果顯示IMP3是區分MM與RMH的重要提示標志物。進一步分析顯示IMP3表達與患者發病部位有關，發生于腹膜者IMP3表達多于發生于胸膜者，可能與本組患者腹膜發病者(腹膜/胸膜比為1.8∶1)比例高有關，而其表達與患者年齡、性別、組織分型、石棉接觸史等均無關。Kaplan-Meier法分析顯示IMP3表達與患者的總生存期有關，提示IMP3是影響MM預后的重要因素。

Glut1是葡萄糖轉運蛋白家族的成員，促進葡萄糖進入細胞，廣泛表達于正常人的紅細胞、胎盤的滋養葉細胞和合體滋養葉細胞、血腦屏障的內皮細胞中，而在其他正常組織中不表達。但當細胞增生活躍、轉化或惡變時，細胞膜葡萄糖攝取和轉運增加，可導致Glut1異常高表達[28]。據報道在包括子宮內膜癌、胃癌以及腎細胞癌等多種惡性上皮性腫瘤中均有Glut1的過表達[29]。研究發現，Glut1在RMH患者中的陽性表達率為13.8%，在MM中為88.0%[1]。本研究結果顯示，Glut1對MM診斷的靈敏度與特異度分別為68%、100%，說明Glut1是一種有效的免疫組織化學標記物，可用于MM與RMH的鑒別診斷。

本研究首次采用了免疫組化的方法聯合檢測EZH2、IMP3及Glut1在MM和RMH組織中的表達。在50例MM中EZH2、IMP3及Glut1的陽性表達率均高于20例RMH，其中EZH2的陽性表達率最高(88%)，但也有10%的RMH患者陽性表達EZH2。本文結果還顯示，Glut1對MM的診斷特異度為100%，但其診斷靈敏度在3個抗體中最低，僅為68%。因此，我們認為單獨檢測3種抗體對MM及RMH的鑒別診斷價值有限，但聯合檢測EZH2、IMP3及Glut1，尤其是EZH2以及Glut1聯合檢測對診斷MM的靈敏度以及特異度可分別達到98%、90%，對MM和RMH的鑒別診斷具有較高應用價值。

綜上所述，MM和RMH的鑒別診斷要結合臨床、組織形態學特點和免疫組化檢測結果等綜合判斷，同時聯合檢測EZH2、IMP3及Glut1 3種抗體對MM的準確診斷和患者預后判斷有重要價值。