表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯對細胞色素P450酶活性的影響

(濰坊醫學院附屬醫院藥學部，山東 濰坊 261031)

茶多酚是茶葉中多元酚類化合物的總稱，其中表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)約占茶多酚總量的50%～60%[1-2]。EGCG含有大量活性酚羥基，是茶葉中生物活性最高的兒茶素[3-5]。研究顯示EGCG具有抗癌、抗突變等生物活性，被廣泛用于提高人體免疫力、降低血脂、預防動脈粥樣硬化等方面，對心血管、內分泌及免疫系統具有保護作用[6-8]。此外，茶葉是亞洲地區人群較受歡迎的飲品之一，定期飲茶已成為一部分人的一種基本生活習慣。在患者接受藥物治療期間，茶葉中的兒茶素類物質可能會與其他藥物產生相互作用，從而影響藥物的療效。

CYP450酶在絕大多數內源性和外源性分子生物代謝過程中，尤其是藥物的代謝過程中均發揮有重要作用[9-10]。在與不同藥物聯用時，CYP450酶能夠介導不同藥物間的相互作用，進而影響藥物活性及治療效果[11]。CYP1A2酶、CYP3A4酶、CYP2A6酶、CYP2E1酶、CYP2D6酶、CYP2C9酶、CYP2C19酶及CYP2C8酶是CYP450酶的主要亞型，參與了約90%藥物的代謝過程，如CYP3A4酶參與了鈣離

子拮抗劑(硝苯地平、尼莫地平等)的代謝過程，CYP2E1酶參與了含氟類的吸入麻醉藥的代謝過程。先前研究已發現有大量影響CYP450酶各亞型活性的藥物，且導致不良的藥物-藥物相互作用，影響藥物的血藥濃度以及代謝速率[12-14]。因此，探究EGCG對CYP450酶各亞型活性的影響，對EGCG的臨床應用及與其他形式的藥物聯用具有重要意義，但目前關于EGCG對CYP450酶各亞型活性的影響還鮮有報道。本研究旨在探討EGCG在人肝微粒體中對這8種主要的CYP450亞型酶活性的影響，并對活性受影響酶的抑制模型進行擬合分析。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

EGCG、非那西丁、對乙酰氨基酚、4-羥基苯甲妥英、7-羥基香豆素、4′-羥基雙氯芬酸、磺胺苯咪唑、奎尼丁、環丙亞胺、氯唑沙宗、6-羥基氯唑沙宗、紫杉醇、6β-羥基睪丸酮、氯甲唑和呋喃茶堿購自美國Sigma公司；孟魯司特購自北京Aleznova制藥(中國北京)；香豆素、雙氯芬酸、右美沙芬和酮康唑購自美國ICN Biomedicals公司；人肝微粒體購自美國BD公司；NADPH購自瑞士Roche公司。

1.2 人肝微粒體實驗

1.2.1實驗分組 實驗分為3組，以未處理的肝微粒體作為陰性對照組，與100 μmol/L EGCG共培養的肝微粒體為EGCG組，陽性對照組為CYP450酶各亞型特異性抑制劑處理組。EGCG反應濃度為100 μmol/L，同時選擇CYP450酶各亞型特異性抑制劑作為陽性對照，其中CYP1A2酶、CYP3A4酶、CYP2A6酶、CYP2E1酶、CYP2D6酶、CYP2C19酶以及CYP2C8酶的特異性抑制劑分別為10 μmol/L呋喃茶堿、1 μmol/L酮康唑、10 μmol/L反式環丙胺、50 μmol/L氯甲咪唑、10 μmol/L噻吩、50 μmol/L丙基環丙胺、5 μmol/L孟魯司特。

1.2.2EGCG對CYP450酶各亞型活性的影響 EGCG對CYP450酶各亞型活性的影響在人肝微粒體中進行，參考之前研究報道設定的標志反應及培養條件[15-16]，如表1所示。孵育體系為200 μL，包括100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.4)，NADPH再生系統(1 mmol/L的NADP+，5 mmol/L的G-6-P，4 kU/L的6-磷酸葡萄糖脫氫酶及5 mmol/L的MgCl2)，一定濃度的人肝微粒體及探針底物(表1)。反應開始前，上述孵育體系需要在37 ℃下預培養3 min，之后加入NADPH系統引發反應。以100 μL乙腈結束反應，其中僅CYP2A6酶反應體系以體積分數為0.1的三氯乙酸結束反應。將混合物置于冰上并進行離心，通過高效液相色譜法(HPLC)定量分析代謝產物。

表1 CYP450酶各亞型標志反應及培養條件

1.2.3抑制模型及相關參數的計算 通過下列方程進行抑制模型相關參數的擬合計算。競爭性抑制：v=(VmaxS)/[Km(1+I/Ki)+S]，非競爭性抑制：v=(VmaxS)/[Km+S(1+I/Ki)]，其中v是反應速率，I是EGCG的濃度，Ki是抑制常數，S是底物濃度，Km是達到最大反應速率(Vmax)一半時的底物濃度。

1.2.4濃度依賴性實驗 分析不同濃度(0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)EGCG對CYP1A2酶以及CYP3A4酶活性的影響，計算兩種酶對應的IC50值。以0～50 μmol/L EGCG孵育不同濃度的兩種探針底物(20、40、60、100 μmol/L睪丸激素及25、50、100、200 μmol/L非那西丁)，分析兩種酶抑制類型及相應Ki值。

1.3 時間依賴性實驗

在含NADPH的系統中將EGCG(20 μmol/L)與肝微粒體(1 g/L)置于37 ℃的條件下先預孵育30 min。孵育后，將等分試樣(20 μL)轉移至另一個孵育管(最終體積為200 μL)中，該孵育管中含有NADPH生成系統和探針底物，使得探針底物最終濃度約為Km。將轉移后的孵育管進一步培養0、5、10、15、30 min后，通過加入100 μL乙腈內標混合物終止反應，然后將培養后的混合物置于冰上，并通過HPLC測定相應的代謝產物。分別于不同的預孵育時間(0、5、10、15、30 min)后，加入較高的探針底物濃度(約4倍Km值)和不同濃度(0、2、5、10、20、30 μmol/L)的EGCG進行培養，重復上述兩步孵化過程。通過不同濃度EGCG對CYP3A4酶剩余活性的自然對數進行回歸分析計算獲得初始速率常數(Kobs)，對Kobs與EGCG濃度進行非線性擬合確定CYP3A4酶失活的KI和Kinact值。其中KI為反應速率達最大失活速率一半時的EGCG濃度，Kinact為酶失活的最大反應速率。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 EGCG對CYP450酶各亞型活性的影響

與陰性對照組相比，陽性對照組CYP450酶各亞型的活性均有顯著降低(F=4.15，P<0.05)，而EGCG組僅CYP1A2酶和CYP3A4酶的活性顯著降低(F=3.92、4.03，P<0.05)，見表2。不同濃度的EGCG抑制實驗顯示，EGCG對CYP1A2酶和CYP3A4酶的抑制作用隨EGCG濃度的升高而增強，EGCG抑制CYP1A2酶的IC50為8.69 μmol/L，抑制CYP3A4酶的IC50為14.07 μmol/L(圖1)。

表2 各組CYP450酶亞型活性比較(χ/%)

2.2 EGCG對CYP1A2酶以及CYP3A4酶的抑制類型

Lineweaver-Burk圖顯示，EGCG對CYP1A2酶的抑制作用為競爭性抑制，反應速率Vmax隨著EGCG濃度增大保持不變，Ki值為4.16 μmol/L(圖2)；而對CYP3A4酶的抑制作用為非競爭性抑制，反應速率Vmax隨EGCG濃度的增大而減小，Km保持不變，Ki值為7.21 μmol/L(圖3)。

另外，時間依賴性實驗顯示，EGCG對CYP3A4酶的抑制作用隨著培養時間的延長而增加，0、2、5、10、20、50 μmol/L濃度EGCG對應的Kobs值分別為0、0.011 1、0.020 4、0.031 5、0.041 9、0.042 3(圖4A)，而對CYP1A2酶的抑制作用不受培養時間影響，CYP3A4酶的KI值為6.38 min-1，Kinact值為0.047(μmol/L)-1(圖4B)。

A：CYP3A4酶，B：CYP1A2酶

A：Lineweaver-Burk圖，B：Ki值的計算圖(縱坐標為圖A各濃度曲線的斜率，橫坐標為EGCG濃度)

3 討 論

CYP450酶是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，作為肝臟中重要的藥物代謝酶，參與多種藥物的體內代謝過程[17-20]。CYP450酶活性直接影響經其代謝的藥物在體內的有效濃度和作用時間，進而影響藥物的藥效及用藥安全性[21-22]。EGCG因其具有抗癌、抗突變等生物活性，廣泛應用于心腦血

A：Lineweaver-Burk圖，B：Ki值的計算圖(縱坐標為圖A各濃度曲線的斜率，橫坐標為EGCG濃度)

A：不同濃度EGCG與CYP3A4酶剩余活性自然對數的回歸分析Kobs值，B：Kobs值與EGCG濃度非線性擬合獲得KI與Kinact

管疾病的臨床治療中[23-27]。在我國居民飲茶文化源遠流長，EGCG是茶葉的主要成分，對CYP450酶各亞型活性影響的相關研究結果，將對藥物聯合使用及用藥期間的飲食具有重要參考意義。

本文研究了EGCG對人肝微粒體中CYP450酶常見的8種亞型活性的影響。結果顯示，EGCG可顯著抑制CYP1A2酶與CYP3A4酶的活性，且對兩種酶活性的影響與EGCG的濃度呈相關性。通過Lineweaver-Burk分析發現，EGCG能夠競爭性抑制CYP1A2酶，而對CYP3A4酶的抑制作用為非競爭性抑制。此外，時間依賴性實驗表明，EGCG對CYP3A4酶的抑制作用受培養時間影響，隨培養時間的延長而增強。這些結果都揭示了在藥物治療期間EGCG可能會使得經CYP1A2酶和CYP3A4酶代謝的藥物代謝速率減慢，出現藥物蓄積現象，造成不良反應甚至毒性積累的現象。

CYP3A4酶占肝內CYP酶總量的近30%，含量最高，且約有50%的藥物代謝需要CYP3A4酶的參與。因此，CYP3A4酶活性的變化對一大部分藥物的代謝具有重要的影響，如大環內酯類抗生素、咪唑類抗真菌藥物等。但CYP3A4酶活性易受到底物、抑制劑、誘導劑及基因多態性的影響。此外，葡萄柚汁、木質素類及黃酮類化合物也是CYP3A4酶活性的重要影響因素。EGCG能夠抑制CYP3A4酶活性，經CYP3A4代謝的藥物會與EGCG發生相互作用，進而對藥物療效產生影響。此外，EGCG對CYP3A4酶的抑制作用受培養時間影響較大，提示在臨床用藥中應將用藥時間作為一個重要影響因素。CYP1A2酶雖僅參與約4%藥物的代謝，但其在藥物和前致癌物代謝及藥物與前致癌物質活化過程中均發揮重要作用。研究結果表明，EGCG對于CYP1A2酶具有競爭性抑制作用，因此，對于經CYP1A2酶代謝的藥物，在臨床應用中要注意茶類的飲用，預防與EGCG發生不良相互作用。

之前的研究發現，EGCG的血漿濃度隨攝入濃度的升高而升高，525 mg EGCG在健康人體內的最大血漿濃度為4.4 μmol/L[28-30]，1 200 mg EGCG的最大血漿濃度約為7.4 μmol/L，接近于EGCG對CYP1A2酶抑制作用的IC50值及CYP3A4的Ki值[31-34]。因此，大量攝入綠茶會增加EGCG的血漿濃度，進而影響其他藥物的藥效和代謝的風險。

EGCG是茶飲中含量較高的兒茶素類物質，也是臨床用于心腦血管及免疫系統疾病防治的常用藥。本研究通過EGCG對人肝微粒體中CYP450酶各亞型活性的影響，為EGCG臨床合理使用及臨床藥物治療中茶葉對藥效以及代謝的影響提供了一定的依據。