不同濃度嗎啡對小膠質細胞極化狀態的影響

(1 青島大學附屬醫院麻醉科，山東 青島 266003; 2 青島大學附屬青島婦女兒童醫院麻醉科)

嗎啡在緩解中重度疼痛中占有重要地位，但長期應用可導致患者嗎啡耐受和(或)痛覺過敏，影響了其在臨床上的應用[1-2]。近年來研究發現，小膠質細胞作為中樞神經系統的巨噬細胞，其不同的活化狀態(M1/M2型)在嗎啡耐受和痛覺過敏中發揮著重要作用[3-6]。嗎啡能夠導致小膠質細胞激活，使白細胞介素1(IL-1)等炎癥因子產生增多，進而產生嗎啡耐受，小膠質細胞活化為M1型時可使IL-1β等促炎因子表達明顯增多[7]。當小膠質細胞活化為M2型時，細胞中的抗炎細胞因子腦源性神經營養因子(BDNF)等表達增多[6]，BDNF能與酪氨酸激酶B(TrkB)受體結合使增強神經元興奮性增高進而導致患者痛覺過敏[8]。但關于小膠質細胞極化狀態在嗎啡耐受和痛覺過敏中的具體作用機制尚不清楚。本研究擬通過不同濃度嗎啡對小膠質細胞極化狀態影響的研究，探討嗎啡耐受和痛覺過敏的產生及調節機制,以便指導臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

大鼠小膠質細胞HAPI株購自賽齊(上海)生物工程有限公司。

1.2 藥品與試劑

Arg-1、iNOS、CD86、CD206和β-actin兔抗大鼠一抗購自美國Abcam公司；羊抗兔二抗購自中國Elabscience公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；L-多聚賴氨酸、青霉素與鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶液以及PBS磷酸鹽緩沖液均購自北京索萊寶公司。

1.3 小膠質細胞的培養

大鼠小膠質細胞HAPI株復蘇后，置于含10×104U/L青霉素與0.1 g/L 鏈霉素的DMEM培養基中，于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫箱中進行培養，待細胞融合度約達70%時，胰蛋白酶消化并吹打成單細胞懸液，按照1∶3傳代。

1.4 分組及處理

取對數生長期的小膠質細胞，以5×105/孔接種于6孔板之中，37 ℃下置于含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養，待細胞融合度約達70%時，采用隨機數字表法將細胞分為空白對照組(C組)、10-7mol/L嗎啡組(L組)和10-4mol/L嗎啡組(H組)3組。C組不作任何處理，L組和H組分別加入終濃度為10-7mol/L和10-4mol/L的嗎啡培養液孵育24 h。

1.5 Western Blotting方法檢測各組小膠質細胞中CD11b、iNOS和Arg-1蛋白表達

將6孔板中孵育后的各組小膠質細胞以PBS清洗后，按照1 mL RIPA裂解液加入10 μL PMSF(100 mmol/L)加10 μL磷酸酶抑制劑的比例每孔加入120 μL裂解液，搖勻置于冰上離心后收集上清液，以BCA法進行蛋白定量，以30 μg蛋白量計算每組的上樣體積，加入上樣緩沖液，煮沸變性。用微量注射器上樣，經SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉移至轉膜液中進行恒流濕轉。轉膜成功后，用50 g/L的脫脂奶封閉PVDF膜2 h,隨后分別加入CD11b(1∶1 000)、Arg-1(1∶1 000)、CD206(1∶1 200)、CD86(1∶1 500)、iNOS(1∶1 000)以及β-actin(1∶2 000)一抗，4 ℃搖床過夜。以TBST液洗膜3次，每次10 min，完成后加入二抗(1∶5 000)孵育1.5 h。以TBST液洗膜3次后，用鑷子夾出膜帶，加入顯色劑，以BIORAD系統測定各組條帶灰度值，計算目的蛋白的表達水平，每組實驗重復3次，實驗結果取均值。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測各組小膠質細胞中BDNF、IL-1β mRNA的表達

將6孔板中孵育后的各組小膠質細胞用PBS清洗后，以Trizol法提取細胞總RNA，檢測RNA的濃度和純度，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應。按照試劑盒說明書的要求配制成20 μL PCR反應體系,并應用Prism?7300型熒光定量PCR儀進行擴增，擴增條件設置為:94 ℃預變性30 s;94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸30 s，循環45次。每個樣品設置3個復孔，得到各組樣品CT值后，以2-ΔΔCT方法計算各組mRNA的相對表達量，實驗重復3次，取均值。β-actin引物序列：正義鏈5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，反義鏈5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；BDNF引物序列：正義鏈5′-AGCCTCCTCTGCTC-TTTCTGCT-3′，反義鏈5′-TGCCTTTTGTCTAT-GCCCCTG-3′；IL-1β引物序列：正義鏈5′-GGTT-TCCCTTTCTGGCGTCCTG-3′，反義鏈5′-TCCC-TCCCTCCCTCCCTTTCC-3′。

1.7 免疫熒光法檢測各組小膠質細胞中CD86和CD206蛋白表達

將處于對數生長期的小膠質細胞接種到各組預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，以PBS浸洗后,以40 g/L的多聚甲醛固定爬片15 min,以體積分數為0.005的Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不清洗，每張玻片分別滴加足夠量的稀釋好的一抗(CD11b抗體、CD86抗體、CD206抗體)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。加熒光二抗,用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察同時采集圖像，采用Image-J軟件測定各組熒光圖片的熒光強度，以此表示CD86和CD206蛋白的表達量。每組實驗重復3次，取均值。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小膠質細胞中CD11b的表達

C、L、H組小膠質細胞中CD11b蛋白表達量比較差異有顯著性(F=85.634，P<0.05)；L、H組與C組比較，差異均有顯著性(t=12.639、13.220，P<0.05)。見圖1、表1。

2.2 不同濃度嗎啡對小膠質細胞M1/M2型極化狀態的影響

C、L、H組小膠質細胞中CD86、CD206、iNOS及Arg-1蛋白的表達量比較，差異具有顯著統計意義(F=30.660～85.968，P<0.05)；L組小膠質細胞中CD206、Arg-1蛋白的表達量與C組比較，差異有顯著性(t=9.740、10.574，P<0.05)；H組小膠質細胞中CD86、iNOS蛋白的表達量與C組比較，差異均有顯著性(t=6.043、11.582，P<0.05)；L組小膠質細胞中CD86、CD206、iNOS、Arg-1蛋白的表達量與H組比較，差異均具有顯著意義(t=3.992～8.278，P<0.05)。見圖1、2及表1。

圖1 不同濃度嗎啡對小膠質細胞各標記物表達的影響

圖2 不同濃度嗎啡對小膠質細胞M1、M2標記物表達的影響

表1 不同濃度嗎啡對小膠質細胞各標記物表達的影響

2.3 嗎啡對小膠質細胞IL-1β以及BDNF mRNA表達的影響

C、L、H組小膠質細胞中BDNFmRNA的表達水平分別為1.000±0.001、3.327±0.210、1.656±0.104，IL-1β mRNA的表達水平分別為1.000±0.001、1.381±0.177、1.838±0.099，三組比較差異有顯著性(F=236.808、13.986，P<0.05)；L、H組與C組比較，差異有顯著性(t=3.732～19.223，P<0.05)；L組與H組相比較，差異具有顯著意義(t=11.843、3.901，P<0.05)。

3 討 論

嗎啡是治療中重度疼痛阿片類藥物的代表，但長期使用會導致患者耐受和(或)痛覺過敏，影響其在臨床上的應用。近年來，針對嗎啡耐受和痛覺過敏產生及調節機制進行了多方面的研究并取得了一些進展，但由于嗎啡耐受和痛覺過敏的機制極其復雜，很多研究尚未得到確切結論。本研究結果表明，L組小膠質細胞中CD206、Arg-1蛋白以及BDNFmRNA表達上調，H組小膠質細胞中CD86、iNOS蛋白和IL-1β mRNA表達上調，提示低濃度嗎啡誘導小膠質細胞向M2型極化狀態分化，而高濃度嗎啡誘導小膠質細胞向M1型極化狀態分化。

小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞，在健康機體中，其處于靜止狀態,能夠通過調控自身的結構功能，從而調控突觸之間的信號傳遞。當機體受到諸如神經損傷等外界刺激時，小膠質細胞會進一步活化，呈現出形態學的改變，從分支狀變成變形蟲樣，其間伴隨著小膠質細胞標記蛋白CD11b的表達增加[9]。當存在嗎啡慢性刺激時，脊髓膠質細胞激活，小膠質細胞活化標記物CD11b的表達增多[10]，促炎細胞因子釋放增加，這是嗎啡耐受和痛覺過敏的主要機制[11-12]。抑制脊髓小膠質細胞活化和(或)促炎性細胞因子釋放，均能降低嗎啡耐受和痛覺過敏的產生[13]。本研究顯示，L組和H組小膠質細胞中CD11b的表達均上調，提示不論是低濃度還是高濃度嗎啡均能活化小膠質細胞。

與外周的巨噬細胞相似，小膠質細胞的極化狀態有M1型和M2型兩種[14]。M1型小膠質細胞主要分泌IL-1β等促炎細胞因子[15]，其中，IL-1β通路的激活對嗎啡耐受的形成起到了重要作用[16]，其能夠增加IFN-γ、IL-6以及TNF-α等促炎因子的釋放，從而增強中樞神經系統的炎癥反應[17]，這些炎癥反應最終導致了嗎啡耐受的形成[18]。另外有報道稱，一些藥物能夠通過抑制小膠質細胞內IL-1β通路的激活，來達到減緩嗎啡耐受的目的[19]。本研究結果顯示，H組M1型小膠質細胞極化標記物蛋白和IL-1β mRNA表達顯著上調，提示高濃度嗎啡(10-4mol/L)刺激小膠質細胞向M1型轉化，并增加IL-1β的合成釋放，這可能是導致嗎啡耐受的可能機制。M2型小膠質細胞可分泌BDNF等大量生長因子[20]。BDNF可激活脊髓背角次級感覺神經元上的TrkB受體，增加K+-Cl-共轉運體KCC2的表達，造成胞內Cl-濃度升高和神經元超極化，從而引起痛覺過敏[21]。反之，通過抑制BDNF的表達也能夠有效減緩痛覺過敏[22-23]。本研究結果顯示，H組M2型小膠質細胞極化標記物蛋白和BDNFmRNA表達上調，提示低濃度嗎啡(10-7mol/L)刺激小膠質細胞向M2型轉化，并增加了BDNF的合成與釋放，這可能是嗎啡導致的痛覺過敏產生的可能機制。

綜上所述，不同濃度嗎啡誘導小膠質細胞不同極化狀態，高濃度嗎啡誘導小膠質細胞活化為M1型，低濃度嗎啡誘導小膠質細胞活化為M2型，這可能分別是產生嗎啡耐受和痛覺過敏的機制。