“魯保一號”菌株的鑒定和生防增效助劑篩選

李健，高興祥，李美，房鋒

(山東省農業科學院植物保護研究所，山東 濟南 250100)

菟絲子是菟絲子屬(Cuscutasp.)植物的通稱，能夠通過吸器汲取寄主的養分，是一類危害嚴重的惡性寄生性雜草。菟絲子廣泛分布于我國黑龍江、甘肅、山東、江蘇、湖南、湖北、江西、廣東等多個省份，對多種作物、牧草、中草藥和觀賞植物的生長構成嚴重威脅[1-3]。菟絲子生活力極強，且易與寄主產生緊密的寄生關系，化學除草劑不僅很難從根本上防除菟絲子，還易對宿主植物造成藥害，且缺乏能夠高效控制菟絲子的化學藥劑。目前我國對環境友好型生物農藥的研發越發關注，市場上對其生物防治的需求較高[4]。

“魯保一號”[5]是山東省農業科學院劉志海等人于1963年研制成功的一種對菟絲子有特殊防效的微生物菌劑[6-8]。20世紀60年代中、后期，曾在山東、江蘇、安徽、寧夏等20多個省區開展了“魯保一號”菌劑的生產和應用，對控制菟絲子的蔓延和危害起到一定作用[8]。雖然“魯保一號”菌株具有較高的應用價值和經濟價值，但由于其應用較早，對其防控效果和致病力方式描述較少。

農藥助劑(pesticide adjuvant)是指能夠改善農藥性能、增強農藥應用效果的一類在農藥田間應用過程中除農藥原藥成分之外的其他輔助物[9,10]。目前微生物農藥助劑應用較為廣泛多樣，對相關生物農藥劑型的改進和防效的增強具有重要作用[11-13]。但在生物農藥助劑應用過程中，要防止助劑對微生物活性的影響，因此篩選與相應微生物具有相容性的助劑至關重要[14]。本試驗對“魯保一號”菌株進行重鑒定，研究其對菟絲子的防控效果和對多種作物的安全性，并篩選出合適的增效助劑，為其深入開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株“魯保一號”保存于山東省農業科學院植物保護研究所。供試宿主為菟絲子；安全性檢測作物為大豆、玉米、小麥、水稻、柑橘、蘋果、梨樹、冬青、黑麥草。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

病原菌分子水平鑒定所需試劑購自日本TaKaRa公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

本試驗用相關助劑由本實驗室保存或購自相應農藥公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分子鑒定 采用PDA培養基活化并擴大培養“魯保一號”菌株，提取其基因組 DNA[14]，應用表1引物分別擴增28S rRNA 基因LSU(GenBank：MT458694)和甘油醛三磷酸脫氫酶基因GAPDH(GenBank：MT459804)的序列。反應體系(20 μL)：10 × buffer 2 μL，dNTP 1 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，酶 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。PCR 反應條件為: 94℃ 4 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，29個循環；72℃ 10 min。擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，BLAST 比對分析，并用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹對該菌進行鑒定。

表1 本試驗所用引物序列

1.2.2 致病力和安全性測定 PDA培養基活化“魯保一號”菌株，7 d后，用0.1%吐溫80配置濃度為1×106個/mL的分生孢子液，按照每666.7m245 L用量均勻噴灑于菟絲子和安全性檢測作物表面。3 d后觀察侵染位置，7 d和14 d后觀察并記錄安全性檢測效果。

1.2.3 農藥助劑對孢子萌發的影響 PDA培養基活化“魯保一號”菌株。根據不同助劑田間使用倍數，配制含有相應助劑的濃度為1×106個/mL的孢子液，25℃黑暗培養，24 h后記錄分生孢子萌發數。

孢子萌發率(%)=處理組萌發數/對照組萌發數×100。

1.2.4 農藥助劑對防效的影響 PDA培養基活化“魯保一號”菌株。根據不同助劑田間使用倍數，配制含有相應助劑的濃度為1×106個/mL的孢子液，按照每666.7m245 L用量均勻噴灑于菟絲子上。3 d后計算感病率，即每2 cm菟絲子莖上的病斑率。14 d后統計鮮重防效：隨機挑選防治組和對照組相同長度(各3條，每條15～20 cm)的菟絲子，每個處理重復3次。

鮮重防效(%)=(對照平均鮮重-處理平均鮮重)/對照平均鮮重×100。

1.3 數據處理與分析

利用SPSS統計軟件分析不同處理間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 “魯保一號”菌株鑒定

基于LSU和GAPDH基因的進化樹(圖1)顯示，該菌與尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)進化關系最近，從分子生物學水平上將該菌株進一步鑒定為尖孢炭疽菌菟絲子專化型(C.acutatumsp.cuscuta)。

A:LSU基因遺傳進化分析; B:GAPDH基因遺傳進化分析;Colletotrichumpyricola: 梨炭疽菌;Colletotrichumfioriniae: 油茶炭疽菌;Colletotrichumkniphofiae:刀狀炭疽菌;Colletotrichumorchidophilum: 蘭花炭疽菌:Colletotrichumhigginsianum: 希金斯炭疽菌;Colletotrichumaotearoa: 奧特阿羅刺盤孢菌;Colletotrichumgloeosporioides: 膠孢炭疽菌;Colletotrichumsiamense: 橡膠樹炭疽菌;Colletotrichumacutatum: 尖孢炭疽菌;Colletotrichumvietnamense: 兜蘭炭疽菌;Colletotrichumdematium: 束狀刺盤孢;Colletotrichumtruncatum: 大豆炭疽病菌;Colletotrichumbrevisporum: 百香果炭疽菌;Monilochaetesguadalcanalensis:瓜達卡納爾瓶梗附孢。

圖1“魯保一號”菌株的系統發育進化樹

2.2 致病力和安全性分析

接菌3 d后，“魯保一號”菌株即可完成對菟絲子的侵染，導致侵染部位呈褐色并逐漸干枯，接菌14 d后，多數菟絲子枯死(圖1A)，鮮重防效可達67.6%。“魯保一號”菌株可以通過菟絲子莖表面完成侵染過程，并形成近橢圓形病斑，病斑邊緣呈深褐色(圖2B)；該菌能夠通過菟絲子侵染過程中形成的吸器入侵菟絲子，導致菟絲子吸器部位黑化(圖2C)。多種植物的安全性試驗顯示，“魯保一號”對大豆、玉米、小麥、水稻、梨樹、冬青和黑麥草安全；接菌3 d后柑橘、蘋果葉片雖產生暗黑色小斑點，但是后期未擴展，未造成葉片病死，總體安全。

2.3 不同助劑對孢子萌發和防效的影響

本試驗研究了目前田間常用的12種助劑，既包括常規化學農藥助劑，也包含微生物農藥專用助劑。孢子萌發試驗顯示，常規田間推薦使用濃度下，多數助劑不影響孢子的萌發，僅兩種助劑(省功寶和G-1801)對孢子的萌發產生顯著影響(表2)。

A：接菌14 d后致病效果觀察；B：莖侵染病斑；C：吸器侵染。

防效試驗顯示，有機改性硅聚醚和Silwet 408對其防效有一定的增進作用，其它助劑無效或會影響該菌株的防效(表2)。

表2 助劑對孢子萌發和防效的影響

3 討論與結論

“魯保一號”菌株是我國第一個大規模應用的生物除草劑，在我國乃至世界范圍內的生物除草劑研究過程中具有舉足輕重的地位，但是因其應用年代較為久遠，對于其致病方式、防控效果的評價缺乏直觀圖文描述[1-3]。早期將“魯保一號”菌株鑒定為膠孢炭疽菌[15]，但缺乏對于其形態描述和分子生物學鑒定的相關數據。本試驗克隆了廣泛應用于真菌分類的相關基因LSU和GAPDH[16,17]，結合早期克隆的ITS序列[5]，通過分析進一步將該菌株確定為尖孢炭疽菌菟絲子專化型(C.acutatumsp.cuscuta)。

本研究首次報道了“魯保一號”菌株初侵染部位和防控效果，結果顯示該菌株防控菟絲子效果顯著。近些年，菟絲子危害越發嚴重[18]，“魯保一號”菌株能夠通過菟絲子吸器部位直接侵入內部，從根源處殺死菟絲子，且不造成宿主作物的藥害發生，說明該菌具有廣泛的應用價值。篩選高性能的“魯保一號”菌可用助劑對于其進一步應用具有重要作用。良好的助劑不僅能增強生防菌的致病力，而且有助于保護生防菌的穩定性，從而促進生物農藥的高效應用[19]。本試驗明確了少數助劑可能抑制孢子的萌發，因此初步篩選至關重要，進一步的防效篩選得到兩種增效助劑，對于“魯保一號”菌株的生產應用具有指導作用。目前，我國對于環境友好型生物除草劑的需求越來越高，本研究表明該菌株具備再開發利用的潛力。