染色體微陣列分析和低深度高通量全基因組測序技術(shù)在流產(chǎn)遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用

沈曄，尹婷婷，袁文博，錢芳波*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院計劃生育科，無錫 214000；2.浙江博圣生物技術(shù)股份有限公司，杭州 310012)

自然流產(chǎn)是指妊娠小于28周、胎兒體重小于1 kg時終止妊娠[1]。臨床上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～25%[2]，其病因十分復(fù)雜，包括遺傳、血栓、內(nèi)分泌、免疫、環(huán)境等因素或多種因素共同作用，其中遺傳因素占比最高[3]。據(jù)報道，超過50%的早期流產(chǎn)是由于胚胎染色體異常導(dǎo)致的[4]，染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱染色體病，是導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)及不孕不育的主要原因。因此流產(chǎn)物樣本的遺傳學(xué)分析，有助于明確本次流產(chǎn)胚胎的遺傳學(xué)病因，減輕患者的心理負擔(dān)，同時為下次妊娠再發(fā)風(fēng)險評估和生育指導(dǎo)提供合理的遺傳咨詢[5]。

染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray analysis，CMA)是將一定數(shù)量的探針固定于支持物上，與帶熒光標記的DNA分子進行雜交，通過檢測每個探針的雜交信號強度，進而獲得樣品中核酸序列的分子數(shù)目和序列信息的高通量方法。低深度全基因組測序也被稱為基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)，是基于二代測序技術(shù)對DNA樣本進行低深度測序，測序結(jié)果與人類參考基因組進行比對，通過生物信息學(xué)分析以發(fā)現(xiàn)受檢樣本可能存在的染色體相關(guān)異常。

本研究通過對89例流產(chǎn)組織分別進行CMA和CNV-seq檢測，以CMA為基準，探討CNV-seq對流產(chǎn)樣本遺傳學(xué)診斷的可行性，評估CMA和CNV-seq技術(shù)在染色體疾病檢測中的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年5月至2019年10月在無錫市婦幼保健院計劃生育門診就診并確診稽留流產(chǎn)行清宮術(shù)的患者共89例(85例流產(chǎn)絨毛，4例流產(chǎn)組織)，年齡20～44歲，孕周6～19周?；颊呒{入標準：(1)無生殖器官器質(zhì)性病變；(2)孕期無病毒感染及有害物質(zhì)接觸史；(3)無相關(guān)自身免疫性疾??；(4)經(jīng)陰道彩超提示胚胎停止發(fā)育?；颊呷恐橥獠⒑炇鹬橥鈺芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

二、研究方法

1.標本處理：清宮手術(shù)中獲取稽留流產(chǎn)患者的流產(chǎn)絨毛或組織，將流產(chǎn)絨毛或組織放置無菌生理鹽水中漂洗3～4次，除去母血成分，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.CMA：使用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的組織提取試劑盒提取流產(chǎn)物基因組DNA，采用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan 750K[55萬個CNV標記和20萬個單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記]SNP微陣列芯片(SNP 750K)對樣本進行檢測，嚴格按照Affymetrix公司提供的標準實驗操作流程進行基因組DNA消化、擴增、純化、片段化、標記，芯片的雜交、洗滌和掃描以及數(shù)據(jù)分析[6]。本實驗的報告閾值為100 kb以上的缺失和200 kb以上的重復(fù)，不報告全基因組中已知屬于正常多態(tài)的拷貝數(shù)變化。

3.CNV-seq：采用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的組織提取試劑盒提取流產(chǎn)物基因組DNA，并用QubitTM 3熒光計測定DNA濃度，應(yīng)用博圣染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)進行文庫構(gòu)建、純化操作，通過KAPA Library Quantification kits對文庫進行定量測定濃度。對定量后文庫pooling并在Illumina 500測序平臺進行測序，最后應(yīng)用軟件對染色體非整倍體及1 Mb以上的CNV進行分析。樣本質(zhì)控后的reads數(shù)不低于8 M，測序深度約0.1×。數(shù)據(jù)分析以人類基因組GRCh37/hg19參考序列為依據(jù)。本檢測僅報告與受檢者臨床表型相關(guān)的CNV，不報告小于1 Mb的片段缺失和重復(fù)，也不報告全基因組中已知良性、疑似良性的拷貝數(shù)變化。

4. 數(shù)據(jù)結(jié)果解讀：參考國際公共數(shù)據(jù)庫，如OMIM(https：//omim.org)、DGV(http：//dgv. tcag.ca/dgv/app/home)、DECIPHER(https：//decipher. sanger.ac.uk/search)、UCSC(http：//genome.ucsc.edu)、PubMed(https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/)、ClinVar(https：//www. ncbi. nlm.nih.gov/clinvar/)、ISCA(http：//dbsearch. clinicalgenome.org/search/)、ClinGen(https：//www.clinicalgenome.org/)及相關(guān)文獻報道等進行CNV的判讀。根據(jù)CNV的性質(zhì)不同，將其分為致病性CNV、不明確意義CNV(variants of unknown significance，VOUS)以及良性CNV三類[7]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

研究采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率(%)進行統(tǒng)計描述，即各組染色體異常陽性檢出率用百分數(shù)(%)表示。

結(jié) 果

一、89例流產(chǎn)樣本的遺傳學(xué)檢測結(jié)果

89例樣本采用CMA和CNV-seq分別檢測，通過質(zhì)控標準分析，兩種方法檢測成功率達100%。其中CMA陽性檢出54例，染色體異常率為60.7%(54/89)；CNV-seq陽性檢出49例，染色體異常率為55.1%(49/89)，詳見表1。

表1 CMA與CNV-seq對89例流產(chǎn)物的檢測結(jié)果比較(n，%)

二、CMA及CNV-seq檢出的染色體整倍體異常結(jié)果比較

CMA檢出三倍體共8例(男女比例為6∶2)，包含嵌合型三倍體3例(男女比例2∶1)；CNV-seq檢出疑似三倍體6例，CMA與CNV-seq檢出的三倍體具體樣本情況見表2。

三、CMA及CNV-seq檢出的染色體非整倍體數(shù)目異常結(jié)果比較

CMA和CNV-seq對于89例流產(chǎn)物的染色體非整倍體數(shù)目異常檢出效率完全一致，共檢出33例，其中檢出常染色體三體28例，特納綜合征5例，具體情況見表3。

表2 CMA與CNV-seq檢出的三倍體結(jié)果比較

表3 CMA與CNV-seq檢出染色體非整倍體結(jié)果(n=33)

四、染色體結(jié)構(gòu)異常檢測結(jié)果比較

CMA共檢出11例染色體結(jié)構(gòu)異常，包括合并缺失重復(fù)2例，缺失5例，重復(fù)4例，其中<1 Mb拷貝數(shù)異常5例，拷貝數(shù)異常范圍為414.1 Kb～34.6 Mb；CNV-seq檢出拷貝數(shù)異常7例，其中合并缺失重復(fù)1例，缺失3例，重復(fù)3例，拷貝數(shù)異常范圍為1 Mb～34.4 Mb。詳見表4。

P18、P29、P55、P64、P74五個樣本拷貝數(shù)異常小于1 Mb，不在本次CNV-seq檢測范圍，CNV-seq均未報告，同時評估這5個區(qū)段的拷貝數(shù)變異均為臨床意義不明(VOUS)的變異。P61號樣本CMA檢出17q25.3區(qū)段1.4 Mb微缺失，CNV-seq未識別P18號樣本染色體長臂末端缺失，實際缺失大小未知，不確定是否大于1 Mb，所以未報告；P78號樣本CMA檢出12p13.33p11.1區(qū)段存在4個拷貝，而CNV-seq判斷為3拷貝；CNV-seq在P23號樣本檢出3p22.3區(qū)段1 Mb的微重復(fù)。對于P38、P72、P83號樣本以及P58號樣本的缺失重復(fù)、P74號樣本的微重復(fù)，CNV-seq與CMA的檢出效力相當(dāng)，不存在顯著差異。CMA與CNV-seq在本次檢測范圍內(nèi)對于缺失重復(fù)異常檢出一致率達77.8%，其中CMA和CNV-seq分別多檢出1例。

表4 CMA與CNV-seq在染色體結(jié)構(gòu)異常上的檢測結(jié)果比較

五、CMA及CNV-seq檢出的嵌合體異常結(jié)果比較

CMA檢出嵌合型常染色體三體4例，嵌合比例為32%～67%，同時對低比例嵌合進行了提示，此外嵌合型重復(fù)檢出1例；CNV-seq檢出嵌合型常染色體三體2例(26號樣本實際為嵌合型三倍體，結(jié)果已在染色體整倍體異常討論)，CMA與CNV-seq檢出嵌合體異常不一致的具體情況見表5。兩種方法對于P14號樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)為嵌合型22號染色體三體，嵌合比例相差13%；CMA檢測P39、P58號樣本均為嵌合型常染色體三體，而CNV-seq未檢出；檢測P39號樣本，CNV-seq數(shù)據(jù)分析時發(fā)現(xiàn)9號染色體存在輕度上移，由于未達到嵌合報告閾值，所以軟件未提示，人工審核時考慮到嵌合比例低，但準確性存在疑問，所以未報告；對于P58號樣本，CNV-seq未發(fā)現(xiàn)7號染色體三體嵌合；同時CNV-seq也未檢出CMA檢出的P72號樣本18q12.1q23區(qū)段存在49.9 Mb低比例嵌合型重復(fù)。

六、CMA及CNV-seq雜合性缺失檢測結(jié)果比較

CMA共檢出雜合性缺失3例，具體結(jié)果見表6，P17號樣本為單親二倍體，P49號樣本為22號染色體單親二倍體，P82號樣本11p15.4p15.1區(qū)段存在11.5 Mb片段的雜合性的缺失。而CNV-seq在89例流產(chǎn)樣本中均未檢測出雜合性缺失。

表5 CMA與CNV-seq檢出嵌合體異常不一致的情況比較

表6 CMA與CNV-seq檢出的雜合性缺失結(jié)果比較

討 論

目前，用于流產(chǎn)標本遺傳學(xué)診斷的技術(shù)中，染色體核型分析是臨床上染色體病診斷的“金標準”[8]，可以檢測染色體數(shù)目異常及大于10 Mb的片段缺失、重復(fù)、易位、倒位等結(jié)構(gòu)異常[9]。但該技術(shù)步驟相對復(fù)雜、技術(shù)性要求較高，同時存在標本采集和送檢過程中易污染、母體細胞污染鑒別困難、細胞培養(yǎng)成功率低(60%～90%)[8]、檢測周期長(3～4周)等問題導(dǎo)致檢測失敗及漏診，限制了其在流產(chǎn)標本檢測時的應(yīng)用。熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(QF-PCR)、熒光原位雜交(FISH)、多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)等[10-11]一般只能對特定染色體的數(shù)目異常進行檢測，無法對全染色體組檢測。國內(nèi)外研究者均對CNV-seq技術(shù)的臨床適用性及準確性進行了評估，Liu等[12]對500例流產(chǎn)樣本進行CNV-seq(0.06×測序深度)和核型分析比較，發(fā)現(xiàn)CNV-seq相比核型分析能夠有效地檢出非整倍體和部分小片段異常，提示CNV-seq是可以有效應(yīng)用于早期胚胎停育的新的遺傳學(xué)診斷技術(shù)。

本研究利用CMA和CNV-seq兩種技術(shù)對流產(chǎn)物進行遺傳學(xué)檢測，對比結(jié)果顯示在不同類型染色體異常中，兩種方法的檢測結(jié)果有一定的差異。

關(guān)于整倍體的檢測，CMA由于涵蓋SNP探針和CNV探針可以很好的檢出，而CNV-seq是通過測序片段與正?；蚪M的對比，無法對染色體整倍體改變進行判斷，所以無法檢測三倍體。但男性三倍體可以通過性染色體X和Y的比例得出疑似三倍體的結(jié)論，女性多倍體則會誤判為其他結(jié)果，如對于26號樣本嵌合型三倍體69，XXX/68，XX，CNV-seq分析軟件會判斷X染色體部分缺失，報告為嵌合型45，X。由于流產(chǎn)胚胎三倍體的比例較高，建議CNV-seq做流產(chǎn)物遺傳學(xué)檢測應(yīng)先做短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)檢測，來排除樣本是否為三倍體。而非整倍體的檢測結(jié)果，CMA與CNV-seq均檢出常染色體三體28例，特納綜合征5例，檢出效力相當(dāng)，一致率達100%。

在染色體缺失重復(fù)的檢測中，本次CNV-seq檢測由于測序深度原因，只檢測1 Mb以上的重復(fù)和缺失，CNV-seq由于測序深度和分析軟件原因漏檢1例17q25.3區(qū)段的微缺失，說明CNV-seq的準確性有待進一步完善；但本次CNV-seq檢測比CMA多檢測出1例3p22.3區(qū)段1 Mb的微重復(fù)，表明CNV-seq檢測能夠發(fā)現(xiàn)芯片探針未覆蓋的染色體拷貝數(shù)異常，進而發(fā)現(xiàn)新的染色體疾病。本次實驗，樣本染色體的缺失或重復(fù)片段長度從414.1 Kb到49.9 Mb不等，當(dāng)涉及大量功能基因或發(fā)育基因時會導(dǎo)致胚胎停育。本研究中共檢出5例臨床意義不明的CNVs，片段大小均<1 Mb，且均不涉及數(shù)據(jù)庫中明確的致病基因。當(dāng)檢測到臨床意義不明的CNV時，一般需要對父母的染色體進行檢測，以確認CNV的來源，最后綜合數(shù)據(jù)庫和文獻來判斷致病等級。Wang等[13]對551例流產(chǎn)樣本進行CMA，發(fā)現(xiàn)致病性微缺失、微重復(fù)31例，片段大小為1.542 Mb～8.883 Mb，而小片段異常(1 Mb以下)往往致病性不明確，較難評估是否為流產(chǎn)原因，為臨床報告解讀增加了難度。因此，CNV-seq在檢測致病性拷貝數(shù)變異中與現(xiàn)有CMA平臺具有幾乎一致的檢測效果。

關(guān)于嵌合體的檢測，CMA的CNV+SNP雙探針設(shè)計可以較好地檢測>30%的嵌合體，但對于異常細胞比例小于30%的嵌合體檢測效率較低[14]，本次CNV-seq檢測由于測序深度僅為0.1×，只能對一定比例的嵌合體進行提示。造成這些差異的原因可能是技術(shù)的差異，CNV-seq測序深度不足，也可能是由于標本不同位置嵌合比例不一致造成的。有研究表明，當(dāng)CNV-seq測序深度增加到0.25×?xí)r，嵌合體分辨率在25%左右[15]。

在雜合性缺失的檢測上，與CMV相比，CNV-seq由于無法進行SNP的檢測，所以無法檢出雜合性缺失。

本研究比較了CMA與CNV-seq在流產(chǎn)組織遺傳學(xué)檢測中的價值，結(jié)果顯示CMA和CNV-seq對流產(chǎn)胚胎全基因組檢測方面準確率高，特異性強，兩種技術(shù)對染色體非整倍體和>1 Mb的拷貝數(shù)異常的檢出率無明顯差異。其中CMA分辨率達100 Kb，在檢測多倍體、單親二倍體等具有明顯優(yōu)勢，而CNV-seq可根據(jù)需要調(diào)整測序深度，以更好地檢出拷貝數(shù)異常以及嵌合體，同時結(jié)合STR檢測可檢測三倍體。

相比于CMA，CNV-seq檢測對于DNA樣本的需求量更小，最低僅需要10～50 ng基因組DNA[16]，遠低于CMA檢測的200 ng。臨床實踐中部分DNA樣本量較少，且DNA完整性欠佳，不能達到CMA的上樣質(zhì)控要求，而CNV-seq可以克服這些缺點；同時近幾年高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了大量推廣和普及，CNV-seq所需要的測序儀可以與其他項目(如產(chǎn)前無創(chuàng)基因篩查)共用，可以一機多用，兼容性更高，避免了額外購買昂貴的染色體芯片專用設(shè)備，因此CNV-seq技術(shù)的普及和推廣也更容易；CNV-seq具有高通量、操作簡便、報告周期短(10個工作日左右)、成本低等優(yōu)勢，同時可以檢測CMA探針未覆蓋區(qū)域，因此CNV-seq結(jié)合STR可為早孕期胎停育和流產(chǎn)提供遺傳學(xué)病因診斷。