多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗患者腸道菌群分析

苑廣慧，郝翠芳，李寧

(1.青島大學醫學部，青島 266000；2.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院，煙臺 264000；3.青島大學附屬青島市婦女兒童醫院，青島 266000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的異質性內分泌疾病，全球范圍內約8%～13%的育齡婦女受其影響。目前病因未明，可能涉及環境、遺傳因素、神經內分泌、行為因素、免疫和代謝功能障礙等多方面，給婦女一生的健康和生活質量帶來影響[1-3]。胰島素抵抗(IR)是PCOS患者最常見的內分泌特征之一，是指機體內生理水平的胰島素不能發揮其正常作用，即器官組織和細胞吸收、利用葡萄糖的效能下降，會代償性的刺激胰島β細胞分泌更多的胰島素，從而引起高胰島素血癥。IR是許多代謝異常疾病的危險因素，例如2型糖尿病、血脂異常及代謝綜合征等[4]。雖然目前IR并未納入PCOS的診斷標準，但其仍被認為是PCOS生殖功能障礙的主要病理基礎。文獻報道，大約50%的PCOS患者存在著不同程度的IR[5-6]。顯然，PCOS與IR之間存在著某種相互作用關系。

隨著計算機測序技術的發展，研究發現腸道細菌數量巨大，是最豐富和功能最關鍵的菌群，涵蓋人類腸道內約1 014種常駐微生物和共生菌，被稱為人體的“第二器官”[7]。腸道菌群以厭氧菌為主，絕大多數位于結腸。盡管是外源性物質，腸道菌群仍可調節宿主基因的表達，在維持人體健康方面起著至關重要的作用。正常人群中腸道菌群需維持特定比例，而腸道菌群的紊亂則參與了人體很多疾病的發生發展。最近的研究顯示，患有PCOS女性的腸道菌群組成發生了顯著變化。而且，腸道菌群失調與肥胖和IR等臨床癥狀密切相關[8-9]，目前已有通過糞菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)等方式調整人體腸道菌群組成達到治療疾病目的的各項試驗，改善腸道菌群已經成為疾病治療的新思路。

鑒于此，分析PCOS伴IR患者的腸道菌群組成特征與健康人群間的差異能有效指導以腸道菌群為靶點進行的藥物設計、生活方式干預及其他治療方式如FMT。本研究通過高通量測序技術檢測出健康女性、PCOS伴IR患者與PCOS不伴IR患者之間腸道細菌組成差異，并進一步分析各菌與患者體質量指數(BMI)、腰臀比(WHR)、炎癥指標、血脂代謝、性激素水平等臨床參數之間的相關性，為后續研究提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選擇2019年7月至2020年6月期間因月經不規則或女性不孕癥就診于青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院的新發PCOS女性，根據穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)分為IR-PCOS組(n=11)和NIR-PCOS組(n=10)。PCOS的診斷參考2003年ESHRE/ASRM鹿特丹專家會議上推薦的診斷標準。HOMA-IR=空腹胰島素(FINs)×空腹血糖(FPGs)/22.5，HOMA-IR≥2.5為IR[10]。排除標準：(1)近3個月接受過促排卵及調整月經周期的治療；(2)近3個月接受過降糖調脂的治療；(3)近3個月接受過胃腸道手術及禁飲食治療；(4)近3個月服用過抗生素；(5)合并有血液系統、心腦血管系統、呼吸系統等嚴重的原發性疾病。健康對照組(HC組，n=11)為同期在毓璜頂醫院體檢中心行孕前檢查的年齡匹配且排卵正常的女性。

本研究遵循赫爾辛基宣言，在入組前均已向受試者講解研究目的、方法及內容，受試者知情同意并簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會審批通過(批件號：煙毓醫倫理審[2019]389號)。

二、主要試劑及儀器

肛拭子購自海門永鳴實驗器材公司，全自動生化分析儀(2nd Centrifuge)購自美國Beckman Coulter公司，E601全自動電化學發光分析儀(2278-15)購自上海羅氏診斷產品有限公司，Miseq 測序儀購自美國Illumina公司，PCR儀購自美國ABI公司，人腫瘤壞死因子α酶聯免疫(ELISA)試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司。

三、研究方法

1.一般指標測量：收集各受試者的年齡、身高、體重、腰圍及臀圍數據。BMI=體重(kg)/身高(m2)，18 kg/m2≤BMI≤24.9 kg/m2為正常，BMI≥25 kg/m2為全身性肥胖；WHR=腰圍(cm)/臀圍(cm)，WHR≥0.85為向心性肥胖[11]。

2.血液樣本采集：于月經第3天清晨采集受試者空腹外周血，用于檢測黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)、FINS、FPG、腫瘤壞死因子(TNF-α)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)。

3.糞便樣本采集：受試者取截石位，采集者將直腸拭子緩慢插入肛門內2～3 cm，于肛門隱窩處取樣，拭子于凍存液封存后盡快置于-80℃冰箱保存，以期保存樣本原始狀態的完整性。

4.DNA抽提和PCR擴增：根據E.Z.N.A.soil DNA kit (Omega Bio-tek，美國)說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增。PCR反應體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，上游引物(5 μM)0.8 μl，下游引物(5 μM)0.8 μl，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μl，模板DNA 10 ng，補足至20 μl。每個樣本3個重復。

5. Illumina Miseq測序：將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，美國) 進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer (Promega，美國)對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：(1)接頭鏈接；(2)用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集；(4)磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。以97%的序列相似性聚類得到相應操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)[12-13]。將生成的OTU表格按最少樣本序列數進行隨機抽平。得到的OTU表進一步細化用于后續分析。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

四、統計學分析

結 果

一、臨床指標特征

本研究共納入33名受試者，其中1名受試者因近期大量飲酒被排除，剩余受試者中HC組11名，新發PCOS患者21名，其中IR-PCOS組11名，NIR-PCOS組10名。年齡范圍19～36歲，3組年齡比較無統計學差異(P>0.05)。IR-PCOS組患者BMI顯著高于另外兩組(P<0.05)。與HC組比較，IR-PCOS組和NIR-PCOS組血漿T、LH、LH/FSH比值和FINS均顯著升高(P<0.05)。其中，相較于NIR-PCOS組，IR-PCOS組的LH、LH/FSH比值和FINS升高更為顯著(P<0.05)。與HC組比較，IR-PCOS組和NIR-PCOS組表現出了一定程度的血脂異常，具體表現為TC和LDL-C顯著升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，但IR-PCOS組與NIR-PCOS組比較未見顯著性差異(P>0.05)；IR-PCOS組和NIR-PCOS組TNF-a水平較HC組顯著升高，在IR-PCOS組患者中達到更高水平(P<0.05)(表1)。

表1 各組臨床參數特征比較(-±s)

二、腸道菌群分析

1.腸道菌群多樣性分析：從上述的32例樣本中總共獲得了1 739 130條高質量的序列，得到了655個OUTs。將生成的OTU表格按最少樣本序列數進行隨機抽平。得到的OTU表進一步細化為每個樣本40 216個序列。3組樣本中HC組特有的OTU數最多，為105個，IR-PCOS組則只擁有28個特有OTU(圖1A)；Alpha多樣性指數表明，IR-PCOS組和NIR-PCOS組均低于HC組，且IR-PCOS組降低更為明顯(圖1B)；將其進行指數間差異檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1C)；從樣本中隨機抽取序列繪制稀釋曲線表明本次測序數據量足夠(圖1D)。

2.組間腸道菌群差異分析：用Qiime計算beta多樣性距離矩陣，雖然IR-PCOS組和NIR-PCOS組存在一定交叉，但仍可直觀展示3組腸道菌群存在差異(圖2A)。而ANOSIM分析即相似性分析則表明3組組間差異高于組內差異(圖2B)。為了更好地進行樣本間區分，取偏最小二乘法判別分析即PLS-DA分析可見3組組內存在相似性(圖2C)。經鑒定，全部樣本主要由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門組成。與HC組相比，PCOS患者擬桿菌門的相對豐度均顯著增高(P<0.05)，在IR-PCOS組增高更為明顯(P<0.001)；而厚壁菌門顯著減少(P<0.01)(圖2D、E、F)。

3.腸道菌群與臨床參數相關性分析：本研究還進一步對PCOS患者腸道菌群和臨床參數的相關性進行了Spearman分析。彎曲桿菌、擬桿菌門、脫硫桿菌門均與HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、LH、LH/FSH、BMI、TNF-α和T呈正相關，與HDL-C和FSH呈負相關。變形菌門、放線菌門和綠彎菌門則與之相反。其中彎曲桿菌和LH/FSH、變形菌門和BMI及綠彎菌門和TC之間的相關性有統計學意義(P<0.05)。其他菌種未見明顯相關性(圖3)。

A：韋恩圖：重疊部分代表多個分組中共有的物種數，非重疊部分代表對應分組特有的物種數目；B：α多樣性分析：OTU水平上采用Shannon指數度量標準的α多樣性分析；C：Wilcoxon秩和檢驗：與IR-PCOS組比較，#P<0.001；與NIR-PCOS組比較，*P<0.05；D：稀釋曲線：曲線趨于平緩表示隨著樣本增加不會再有更多的核心物種出現。圖1 腸道菌群多樣性分析

A：在門水平基于bray-curtis距離算法的Beta分析；B：相似性分析：Between對應組間差異距離值，其余為組內差異；C：門水平上的PLS-DA法：X軸、Y軸的刻度是相對距離，無實際意義，Comp1、Comp2分別代表對于兩組樣本微生物組成發生偏移的疑似影響因素；D：門水平上的群落組成Bar圖；E：Kruskal-Wallis檢驗:與HC組比較，*P<0.01，#P<0.001；F：Circos圖:小半圓(左半圈)表示樣本中物種組成情況，大半圓(右半圈)表示該分類學水平下物種在不同樣本中的分布比例情況。圖2 組間腸道菌群差異分析

注：紅色代表呈正相關，藍色代表呈負相關；*P<0.05圖3 腸道菌群與臨床參數相關性分析

討 論

近年來PCOS發病率逐漸增高，對育齡期婦女的生活質量造成了嚴重影響，主要體現在疾病所致的不孕問題、體型改變及情緒變化等方面[14]。其病因研究一直為現代醫學的一大難題，因其排卵障礙和IR的機制仍不明確，從而限制了治療藥物的開發。現在越來越多的研究者發現PCOS患者與健康人群之間以及不同表型PCOS患者間的腸道菌群存在差異。Torres等[15]研究發現卵巢多囊樣改變人群相較于健康人群腸道菌群的多樣性降低。Lindheim等[8]也發現PCOS患者菌群中3個細菌類群的相對豐度較低，分別為軟壁菌門、ML615J-28目及S24-7科。Liu等[11]發現PCOS患者的菌群與肥胖對照組的菌群失調有著相似性。本研究也證實了PCOS患者腸道菌群與健康人群存在差異，主要表現為多樣性的減低及菌群組成比例的改變，包括擬桿菌門相對豐度升高，厚壁菌門顯著減少，而PCOS伴IR患者的菌群改變更為明顯。

Zeng等[9]研究發現PCOS人群存在血脂紊亂及一些指標如LH、LH/FSH、TNF-α和T的異常升高，伴IR型PCOS患者異常程度更高。將這些臨床參數與腸道菌群進行相關性分析，發現擬桿菌門與HOMA-IR、T、炎性細胞因子、LH、脂質水平呈正相關，與FSH、雌二醇(E2)呈負相關，認為包括擬桿菌門在內的促炎細菌通過炎癥機制在IR中發揮重要作用。本研究也證實了伴IR型PCOS患者存在著更為明顯的血脂紊亂及指標異常，并且進一步研究發現彎曲桿菌、擬桿菌門、脫硫桿菌門與HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、LH、LH/FSH、BMI、TNF-α和T呈正相關，與HDL-C和FSH負相關，提示這些菌可能是加重PCOS癥狀的菌種。相反變形菌門、放線菌門和綠彎菌門則可能是改善PCOS癥狀的菌群。在后續的治療方向中可能要考慮調整這些菌群在腸道菌群中的占比。鑒于此，本研究推測腸道微生物群可能通過腸腦軸及其他病理機制的變化參與了PCOS的發病過程，通過改善腸道菌群或許能達到改善PCOS癥狀的目的。

盡管眾多學者針對PCOS人群腸道菌群展開研究，但均未獲得一致結論。樣本量較小和區域差異是極大的干擾因素，這也是本研究的不足之處。雖然稀釋曲線顯示測序數據量足夠，但人群屬于個體特異性很強的樣本，地域差異和飲食習慣對腸道菌群影響很大，小樣本、單地區的研究很容易掩蓋平均特性。因此，要增加樣本量并進行多地區研究以補充現有數據庫。此外，本研究未納入伴IR的非PCOS患者，且本研究納入的IR型PCOS患者BMI較高，之前有研究發現BMI也會對腸道菌群造成較大的影響[16]。所以后續研究中納入一組BMI無統計學差異的伴IR的非PCOS組十分有必要。最后，通過宏基因組學和代謝組學對腸道菌群進行研究也可能會有新的發現。

總之，雖然本領域對于PCOS患者腸道菌群特征還未達成共識，但現有的研究已有充分的證據表明腸道微生物群與PCOS內分泌和代謝紊亂之間可以相互作用，互為因果。因此，全面探索PCOS發病過程中腸道菌群的變化規律，研究腸道菌群對PCOS發病機制的影響，甚至找出阻止PCOS發生發展的優勢菌株，通過調整飲食、運動、合理應用FMT及藥物治療等方法調整腸道菌群從而改善PCOS癥狀，有望成為治療PCOS的新思路。