IGF-2、IGFBP-3在胎兒生長受限患者胎盤組織中的表達及其臨床意義

殷欣欣，崔照領，馬麗靜，莫世嬌，楊永紅，莫中福

(石家莊市婦幼保健院1.產科；2.功能科；3.婦產急診ICU；4.產前診斷中心；5.婦產科，石家莊 050000)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)屬于臨床上妊娠疾病，指胎兒無法在子宮內充分發揮其生長潛能，導致足月妊娠胎兒出生體重<2 500 g或胎兒體重低于同孕齡平均體重的兩個標準差或第10百分位數，其發病率高達5%～10%，是圍生兒發病及畸形的主要病因之一，嚴重者可威脅生命[1-3]。目前FGR臨床診斷困難，療效甚微，其病因多及機制復雜，迄今仍未完全明了，因此尋求分子生物學診斷指標深入探尋其發病機制并監測、評估胎兒生長狀況對臨床及早采取相應措施改善預后具有重要意義。胎盤是胎兒生長發育、維持血運充足及營養物質攝取的重要保障，若其發生功能障礙則會對胎兒自身發育造成嚴重影響[4-5]。胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)是胰島素樣生長因子(IGFs)系統成員之一，血液中主要來自于肝臟，對人體細胞、器官的正常生長、分化、發育有重要作用，可以通過自分泌或旁分泌方式結合相應受體，進一步調節細胞生長、增殖、分化等[6]。蔡滿紅等[7]研究發現，妊娠期糖尿病巨大兒患者胎盤組織中IGF-2水平顯著高于正常對照組，且提示IGF-2高表達水平與妊娠期糖尿病巨大兒發生關系密切。胰島素樣生長因子結合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3)是一種細胞外分泌蛋白，能與IGFs結合并調節游離IGFs活性參與胎兒生長發育[8]。陶麗靜等[9]研究發現，妊娠期糖尿病巨大兒患者臍血中IGFBP-3水平顯著高于正常妊娠組，提示IGFBP-3水平與胎兒宮內發育密切相關。目前關于IGF-2、IGFBP-3在產婦外周血及新生兒臍血中表達水平與胎兒生長發育關系研究較多，而在FGR患者胎盤組織中的表達情況及意義少有報道，因此本研究同時分析二者在FGR患者胎盤組織中表達及意義，以期為深入研究FGR發病機制提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年12月至2019年12月于本院經超聲確診FGR并住院分娩的孕婦110例為FGR組，年齡22～36歲。納入標準：(1)符合樂杰主編的《婦產科學》第9版教材[10]中有關FGR診斷標準；(2)一般資料完整；(3)單胎無合并癥孕婦。排除標準：(1)心臟、肝臟、腎臟功能異常者；(2)原發性高血壓患者；(3)患有妊娠合并癥如前置胎盤患者；(4)妊娠合并癥者；(5)胎兒染色體異常者。另選擇在本院同期分娩的正常單胎足月孕婦110例為對照組，年齡20～35歲。所有受試者均為單胎、初產婦，月經周期規律、末次月經明確。本研究經本院醫學倫理委員會審批并通過。

二、主要試劑及儀器

TRIzol試劑(MN562J2)、逆轉錄試劑盒(J6547M)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(N5643MJ)購自美國Sigma公司；TakaRa PrimeScript RT試劑盒(ND6527J)、SYBR Premix ExTaq試劑盒(GH8935K)均購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；IGF-2、IGFBP-3及內參GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成；鼠抗人IGF-2多克隆抗體(ND4672-8)、鼠抗人IGFBP-3多克隆抗體(M9382-9)，購自北京中衫金橋生物技術有限公司；內源性過氧化酶阻斷劑(627925)、正常山羊封閉血清(M78320J)、生物素標記的IgG(O6721D)、DAB顯色試劑盒(67869NJ)，均購自福州邁新生物技術有限公司。熒光定量PCR分析儀(YFGB1022，Olympus，日本)。

三、研究方法

1.標本采集及處理：兩組受試者均于剖宮產胎盤娩出后，于臍帶連接于母體面中央處(避開壞死及鈣化區)立即切取胎盤組織(大小約1 cm×1 cm×1 cm)兩塊。其中一塊置于-80℃保存備用。另一塊經生理鹽水洗凈后于10%甲醛溶液中固定，24 h后石蠟包埋，連續切片，制成3張切片(4 μm厚)，65℃烤箱過夜，保存于37℃溫箱，用于免疫組化測定。

2.qRT-PCR：從-80℃取出胎盤組織樣本，按照RNA試劑盒說明書提取總RNA后，按照反轉錄試劑盒說明操作將RNA反轉錄為cDNA。嚴格按照qRT-PCR試劑盒說明進行qRT-PCR反應，所用引物序列見表1。反應體系為20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應程序：95℃ 20 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個循環。以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA相對表達水平。

表1 引物序列

3.免疫組織化學實驗及結果判定：取FGR組及對照組胎盤組織切片，經脫蠟復水，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加0.3%過氧化氫甲醇液以阻斷內源性過氧化酶活性，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加5%正常山羊血清進行封閉，室溫孵育10 min；滴加鼠抗人IGF-2(1∶500)、IGFBP-3(1∶500)抗體作為一抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加生物素標記二抗(1∶1 000)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次(3 min/次)；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)溶液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次(3 min/次)；滴加新鮮配置的DAB顯色液(0.04 DAB+0.03% H2O2)顯色，顯微鏡下控制，充分水洗；蘇木素復染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，應用NIS Elements F 3.0圖像采集軟件和NIS Elements BR 3.0圖像分析軟件(日本Nikon公司)進行圖像采集。

結果判定：IGF-2、IGFBP-3蛋白表達均以胞漿和/或胞膜呈棕黃(褐)色顆粒為陽性；從每個切片中隨機選取5個高倍視野的500個細胞，對細胞染色強度、陽性細胞百分比進行評分。(1)按細胞染色強度計分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞所占的百分比計分：小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。取上述兩項結果的乘積：≤3分為蛋白在組織中陰性(-)表達，>3分為蛋白在組織中陽性(+)表達。蛋白的陽性表達率(%)=各組蛋白陽性表達人數/各組總人數×100%。

4.分析指標：包括年齡、孕前體質量指數(BMI)、終止孕周、胎兒體重、孕早期相關血漿蛋白A(Pregnancy-related plasma protein A，PAPP-A)及游離人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平。

四、統計學方法

結 果

一、一般資料比較

兩組間年齡、孕前BMI、終止孕周、HCG水平比較無顯著性差異(P>0.05)；FGR組的胎兒體重、PAPP-A水平顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組一般資料比較(-±s)

二、兩組胎盤組織IGF-2及IGFBP-3的mRNA表達水平

與對照組比較，FGR組患者胎盤組織中IGF-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，IGFBP-3 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 兩組胎盤組織IGF-2、IGFBP-3 mRNA相對表達量比較(-±s)

三、兩組胎盤組織IGF-2、IGFBP-3蛋白表達情況

兩組胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白均有不同程度表達，IGF-2陽性染色呈橘黃色顆粒，位于胞漿；IGFBP-3陽性染色呈棕黃色/褐色顆粒，位于胞漿及胞膜(圖1)。

蛋白陽性表達率統計結果顯示，與對照組比較，FGR組患者胎盤組織中IGF-2蛋白陽性表達率顯著降低(P<0.05)，IGFBP-3蛋白陽性表達率顯著升高(P<0.05)(表4)。

四、FGR組患者胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白表達的相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示，FGR患者胎盤組織中IGF-2和IGFBP-3的蛋白表達成顯著負相關(r=-0.537，P=0.008)(表5)。

五、FGR影響因素的Logistic回歸分析

以是否發生FGR為因變量，排除年齡等混雜因素后，以孕早期血清PAPP-A水平、胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA水平為自變量，進行二元Logistic回歸分析。結果顯示，孕早期血清PAPP-A水平及胎盤組織中IGF-2 mRNA異常低表達、IGFBP-3 mRNA異常高表達與FGR發生顯著相關(P<0.05)(表6)。

注：白色箭頭指胞漿和/或胞膜呈棕黃(褐)色顆粒處，即IGF-2、IGFBP-3蛋白的陽性表達。圖1 胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3的蛋白表達定位(SP染色法，×200)

表4 兩組胎盤組織IGF-2、IGFBP-3蛋白陽性率比較[n(%)]

表5 FGR患者胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白表達相關性分析

表6 FGR的影響因素的Logistic分析

討 論

FGR指由于受到各種不利因素的影響，胎兒的生長未能達到潛在應有的遺傳速率，是圍生期主要并發癥之一，給圍產兒、新生兒生命健康帶來嚴重威脅[11]。FGR病因復雜，發病機制尚未完全闡明，臨床上缺乏對FGR的早期監測指標及有效診斷手段，治療措施更是較為單一。因此，尋求可靠的生物學指標及早合理監測、準確評估胎兒生長發育情況并選擇合適分娩方式，適時終止妊娠對于改善FGR預后有重要意義。

胎盤是妊娠期特有器官，作為胎兒與母體進行營養交換的重要場所，其正常結構、功能發生改變則會對胎兒發育造成直接影響[12]。IGF-2是一種肽類生長因子，其編碼基因位于11號染色體短臂，由67個氨基酸組成，屬于一種強有絲分裂源，能夠與相應受體結合促進細胞有絲分裂及發揮抗凋亡作用，能夠調節細胞生長、增殖、分化等生物學行為；人體許多器官組織如胎盤、肝臟均能合成IGF-2。研究表明，IGF-2可以刺激葡萄糖在胎盤的合成及轉運，對胎盤功能、胎兒生長發育有重要作用[13]。柴涵婧等[14]研究發現，單絨毛膜雙羊膜囊雙胎選擇性宮內生長受限患者胎盤組織中IGF-2基因表達降低，提示胎盤組織中IGF-2基因異常低表達可能與FGR有關。本研究結果顯示，FGR組患者胎盤組織中IGF-2 mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，兩組胎盤組織中IGF-2蛋白均主要存在于組織細胞胞漿中，呈橘黃(褐)色；FGR組患者胎盤組織中IGF-2蛋白陽性表達率顯著低于對照組(P<0.05)，與以往研究結果趨勢一致，提示胎盤組織中IGF-2 mRNA及蛋白異常低表達可能與FGR發生發展關系密切。原因可能是IGF-2基因低表達使胎盤營養轉運功能發生障礙，進一步干擾胎兒正常生長，導致胎兒發生宮內生長受限。

IGFBP-3是含有264個氨基酸的多肽類物質，位于7號染色體上，主要由肝臟合成，人子宮內膜、胎盤及胎兒肝臟均可以表達IGFBP-3 mRNA，是IGFs的主要載體調節蛋白，能夠與IGFs受體競爭結合IGFs，從而減弱IGFs的生物學作用，如抑制細胞有絲分裂、促進細胞凋亡等，進一步抑制細胞生長、增殖、分化等[15]。謝偉姣[16]研究發現，與正常對照組比較，分娩巨大兒的妊娠期糖尿病產婦胎盤組織中IGFBP-3 mRNA水平明顯降低、IGF-2 mRNA水平明顯升高，提示二者可能與妊娠期糖尿病巨大兒發生有關。本研究結果顯示，FGR組患者胎盤組織中IGFBP-3 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，兩組胎盤組織中IGFBP-3蛋白主要存在于胎盤組織細胞胞膜及胞漿中，呈棕黃(褐)色；且與對照組比較，FGR組患者胎盤組織中IGFBP-3蛋白陽性表達率顯著升高(P<0.05)。與謝偉姣研究結果趨勢一致，提示胎盤組織中IGFBP-3 mRNA及蛋白異常高表達可能與FGR發生發展關系密切。原因可能是IGFBP-3蛋白與IGF-2受體競爭性結合IGF-2，從而減弱IGF-2的生物學作用，進一步抑制細胞生長、增殖、分化等，促進FGR發生。進一步相關性研究顯示，FGR患者胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白表達成負相關。提示二者可能相互作用并參與FGR的發生發展。

PAPP-A是一種從孕婦血清分離而得的來源于胎盤組織的鋅結合金屬蛋白酶，是孕婦血清學產前篩查的重要生化指標，由合體滋養層細胞合成分泌，對早期配子發育、維持早期胎盤滋養層細胞浸潤分化及胎兒在胎盤生長有關鍵作用[17]。本研究二元Logistic回歸分析顯示，孕早期血清PAPP-A水平及胎盤組織中IGF-2 mRNA異常低表達、IGFBP-3 mRNA異常高表達可能與FGR發生顯著相關，提示孕早期血清PAPP-A水平及胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA異常表達可能是FGR發生的重要影響因素，但是否是FGR發生的危險因素有待進一步探究。

綜上所述，胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA異常表達可能在FGR發生發展過程中發揮作用，但具體作用機制及意義有待于后期深入探討。