雌、孕激素受體在反復移植失敗伴慢性子宮內膜炎患者子宮內膜中的表達及意義

武露明，張虹，沈豪飛，王奕翔，賈天玉，張學紅，王一青*

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院生殖醫學中心 甘肅省生殖醫學與胚胎重點實驗室，蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院病理科，蘭州 730000)

隨著醫療水平的快速發展，輔助生殖技術可以滿足大部分不孕不育患者的生育要求，但仍有40%的患者不能受孕，其中包括反復移植失敗(recurrent implantation failure，RIF)[1]。RIF一直是困擾臨床醫生和胚胎學家的難題，多個周期的移植失敗會給患者帶來心理壓力和經濟負擔等諸多問題。研究發現慢性子宮內膜炎(chronic endometritis，CE)與RIF相關，CE在RIF人群中發病率為7.7%～56.1%[2-5]。CE是一種持續存在于子宮內膜局部的慢性炎癥，臨床常表現為無癥狀，少數表現為異常子宮出血、盆腔疼痛、性交困難和白帶增多等[6]。CE診斷的金標準為子宮內膜間質漿細胞浸潤，CD138是漿細胞的標記物，現在已經成為篩查CE的可靠標志物[7]，臨床針對可疑CE患者常采用CD138免疫組化檢查。子宮內膜類固醇激素水平在胚胎著床中起到關鍵作用，激素不足將導致胚胎著床失敗。目前研究雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達于宮腔粘連患者子宮內膜的情況較多[8-9]，但有關CE的研究較少。本研究通過檢測CE患者內膜組織中ER與PR的表達情況并分析其相關性，以期對臨床治療提供新的參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年1月至2019年6月就診于蘭州大學第一醫院生殖醫學中心的RIF患者80例(RIF組)和同期就診、暫未接受胚胎移植助孕治療的80例不孕患者(對照組)的臨床資料。RIF組的納入標準：40歲以下的患者；接受3次及以上胚胎移植周期(包括新鮮及冷凍移植周期)；累積移植至少4枚卵裂期優質胚胎而未能獲得臨床妊娠。對照組的納入標準：40歲以下從未接受過胚胎移植周期的不孕患者。排除標準：絕經及圍絕經期女性；凝血功能障礙；認知功能障礙；子宮或附件切除女性。

RIF組中接受ER和PR受體檢測的患者共34例，根據是否患有子宮內膜炎(CE)再次分組，分別為CE組(n=14)與非CE組(n=20)。CE的診斷參考其宮腔鏡下特點：(1)子宮內膜局灶或彌漫性充血(草莓征)；(2)子宮內膜間質水腫(與月經周期不符的內膜增厚、發白、表面不規則)；(3)子宮內膜微小息肉樣改變(息肉直徑小于1 mm)。

二、主要試劑和儀器

CD138鼠抗人單抗(MAB-0200)、PR兔抗人單抗(Kit-0013)、ER兔抗人單抗(Kit-0012)、即用型快捷免疫組化MaxVisionTMHRP試劑盒(抗鼠/兔，Kit-5030)及DAB顯色試劑盒(DAB-0031)均購自福州邁新生物技術開發有限公司；組織脫水機(TP1020，徠卡，德國)，石蠟包埋機(KEDEE-KD-BMII，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、石蠟切片機(RM2245，徠卡，德國)，羅氏全自動免疫組化儀 (BenchMark XT，瑞士)，顯微鏡及圖像采集系統(IX73，OLYMPUS，日本)。

三、研究方法

1.宮腔鏡檢查及子宮內膜收集：兩組患者均采用德國史托斯宮腔鏡觀察月經干凈后3～7 d內的子宮內膜情況，并刮取部分子宮內膜送檢。本研究中所涉及操作均征得患者同意并簽署知情同意書。

2.免疫組化法檢測子宮內膜組織中CD138、ER和PR的表達情況：宮腔鏡術后刮取部分子宮內膜標本，經多聚甲醛固定，常規脫水、包埋、切片(4 μm)后，放入羅氏全自動免疫組化儀進行免疫組化染色，其中一抗孵育時間60 min，二抗孵育時間30 min，所用抗體均為即用型抗體。檢測判斷標準采用Kaku等[7]提出的：10個非重疊高倍鏡視野中至少檢出3個漿細胞定義為陽性；檢出漿細胞小于3個則為陰性。CD138陽性率=子宮內膜組織CD138陽性患者例數/該組患者總例數×100%。

ER或PR染色為棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，常位于細胞核。每張片子隨機取5個視野，放大400倍計數每張鏡片陽性細胞的百分率并進行評分，其中陽性細胞百分率1%～10%為1分；11%～25%為2分；26%～50%為3分；51%～75%為4分；大于75%為5分；每張切片亦根據細胞染色強度進行評分，分別記為1、2、3、4、5分。每張切片的總評分=染色強度評分+陽性細胞百分率評分/2。結果判定均由同一名病理科醫師進行。

四、統計學方法

結 果

一、兩組患者的一般情況比較

兩組患者的年齡、不孕年限、月經周期、體重指數(BMI)、孕次、產次和雙側基礎竇卵泡計數(AFC)比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般情況比較(-±s)

二、免疫組化法檢測兩組患者子宮內膜組織中CD138的表達情況

免疫組化染色發現，RIF組患者子宮內膜組織中CD138陽性率為17.5%(14/80)，對照組中CD138陽性率2.5%(2/80)，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

A：CD138表達呈陽性子宮內膜間質(箭頭所示為陽性細胞)；B：CD138表達呈陰性的子宮內膜間質；C：兩組患者子宮內膜CD138陽性率比較。與對照組比較，*P<0.05圖1 兩組患者子宮內膜組織間質中CD138的表達情況及比較(免疫組化，×400)

三、RIF中CE組與非CE組患者子宮內膜中ER和PR的表達情況

RIF組中接受ER和PR受體檢測的患者共34例，根據是否患有CE分為CE組(n=14)與非CE組(n=20)。免疫組化染色發現，在子宮內膜的間質及腺體中均存在ER和PR表達(圖2)。統計結果顯示，CE組與非CE組中ER的表達有顯著性差異(P<0.05)；而PR的表達組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

A：非CE組ER的表達情況；B：CE組ER的表達情況；C：非CE組PR的表達情況；D：CE組PR的表達情況圖2 CE組與非CE組患者子宮內膜中ER和PR的表達情況(免疫組化，×400，黑色箭頭表示腺體，紅色箭頭表示間質)

與非CE組比較，*P<0.05圖3 CE組與非CE組患者ER和PR表達的評分比較

討 論

子宮內膜受到雌孕激素的調控，其中雌激素對內膜上皮細胞的增殖、形態變化、細胞分化和分泌起到重要作用。ER的表達在子宮內膜增生早期達到高峰，在子宮內膜增生晚期和分泌早期略有下降。ER是雌激素影響子宮血管重建和內膜再生的橋梁。有研究發現在不明原因的不孕患者中子宮內膜ER和PR的陽性表達顯著減少(P<0.05)，認為ER和PR表達下降會導致子宮內膜成熟障礙及內膜對胚胎植入的容受性改變[10]。Guleria等[11]在一項前瞻性研究中發現，放置宮內節育器患者的子宮內膜ER和Ki-67蛋白表達顯著降低(P<0.05)，但血清雌二醇和孕酮水平無顯著變化(P>0.05)，提示血清性激素水平不一定能準確反映子宮內膜激素受體狀態。

有研究表明，子宮內膜微生態失調是IVF、RIF及復發性流產的重要原因之一[12]。子宮內膜微環境影響子宮內膜激素受體狀態，在正常月經周期中腺體和基質對類固醇調節的敏感性是不同的。有研究認為20%的CE患者子宮內膜腺腔和間質中有中性粒細胞聚集，彌漫性炎癥的存在可能干擾子宮內膜腺體和基質細胞ER的表達[13]。此外，越來越多的證據表明，生殖道炎性反應在宮腔粘連的發病中亦扮演了重要角色。早在19世紀80年代，就有學者提出慢性或亞急性子宮內膜炎是宮腔粘連形成的危險因素[14]。Czernobilsky[15]認為，宮腔粘連是子宮內膜在慢性炎癥作用下形成的纖維化型子宮內膜炎。而宮腔粘連也是引起RIF的一個重要原因。近年來有研究亦表明，宮腔粘連合并CE的患者粘連復發率顯著高于非CE組(44.8% vs. 20.8%)[16]，提示宮腔粘連患者同樣伴有子宮內膜微環境的改變。國內一些學者的研究也側面驗證了這一觀點，他們發現宮腔粘連患者子宮內膜組織中ER表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，PR在子宮內膜組織中的表達與對照組則沒有顯著性差異(P>0.05)，而且ER表達水平與宮腔粘連術后雌激素治療的療效呈正相關[9，17]。

本研究基于Liu等[18]的研究結果，依據CD138免疫組化染色結果將RIF組患者根據是否患有CE進一步分為CE組與非CE組，并對子宮內膜分別進行ER和PR免疫組化染色發現，CE組患者子宮內膜中間質與腺體中的ER表達水平顯著高于非CE組(P<0.05)，但兩組患者子宮內膜間質及腺體中PR的表達比較并無顯著性差異(P>0.05)。Gibreel等[19]發現，不孕患者行子宮內膜搔刮術后加用雌孕激素聯合治療對CE有效，ER高表達的CE患者對雌激素更加敏感，行子宮內膜搔刮術可以導致內膜局部的損傷，聯合應用雌孕激素可以促進子宮內膜蛻膜化，從而提高胚胎移植移植率。

綜上所述，RIF與CE具有相關性，針對有3次及以上胚胎移植周期失敗的患者建議行免疫組化染色，以排除子宮及內膜因素對胚胎著床的影響；且ER在CE患者子宮內膜間質中高表達，提示對于CE患者同時檢測ER的表達情況對于后續制定個性化激素治療方案有益。但本研究尚存在一定的局限性，首先本研究未檢測藥物治療后ER和PR的表達情況；其次樣本量過少。后期尚需要大樣本的多中心研究進一步探討ER和PR在CE患者子宮內膜中的表達，同時應了解炎性狀態下內膜功能層及基底層ER和PR的表達情況。