TWIST2通過調控FGF21介導的AMPK/mTOR通路誘導卵巢癌細胞氧化應激和凋亡

盛連兵，劉皎婧，雷麗君，楊慧軍

(山東省婦幼保健院生殖醫學中心，濟南 250014)

TWIST相關蛋白2(TWIST2)屬于堿性螺旋-環-螺旋(Basic helix-loop-helix protein，bHLH)家族B類成員[1]，在骨發育、腫瘤發生與進展和上皮間充質轉化過程中起著至關重要的調控作用[2-3]。目前，關于TWIST2在卵巢癌中作用的研究報道較少，僅有報道其在卵巢癌患者癌細胞中的表達情況[4-5]，但其在卵巢癌細胞中的功能仍需要進一步探究。

成纖維細胞生長因子21 (FGF21)主要在肝臟中合成，被認為是一種肝臟激素，在控制肝臟脂質代謝過程中發揮一系列作用，但對其在癌癥中的研究較少[6-7]。有文獻報道，TWIST2對FGF21的表達具有調控作用，當TWIST2過表達時，可以通過調控FGF21進而緩解肝細胞的脂肪變性、抑制炎癥、增加線粒體含量并改善其功能，從而在維持肝臟穩態中發揮重要作用[8]。AMPK是一種異源三聚體蛋白質激酶，缺氧應激可激活細胞內的AMPK，其在能量代謝和凋亡的調控中起到重要作用[9]。mTOR是一種絲氨酸蛋白質激酶，可接受并整合細胞內外的各種刺激，調節細胞生長、增殖、自噬、凋亡等生物行為。mTOR被認為是AMPK的下游分子，細胞內AMPK被激活后可通過調控mTOR磷酸化水平，進而促進細胞凋亡[10]。

本研究旨在探究TWIST2是否通過調控FGF21介導的AMPK/mTOR通路影響卵巢癌細胞的氧化應激和凋亡以及其作用機制，從而為臨床上卵巢癌的治療提供新的理論依據。

材料與方法

一、材料和主要試劑、儀器

1.組織樣本和細胞系：收集2018年6月至2019年10月在山東省婦幼保健院治療并經病理確診的30例卵巢癌患者的癌組織和癌旁組織，樣本大小約500 mg，離體后20 min內快速行冰凍病理檢查確認，液氮中保存備用。本研究獲得醫院倫理委員會批準，患者均對研究知情并簽署知情同意書。研究所用卵巢癌細胞系(SK-OV-3、HO-8910、COC1和A2780)和正常卵巢上皮細胞(IOSE80)購自中國科學院昆明動物研究所。

2.試劑和儀器：Trizol、反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自美國Promega公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清、雙抗購自美國HyClone公司；BCA蛋白質定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TWIST2兔抗鼠單克隆抗體、FGF21兔抗鼠單克隆抗體、NF-κB(p-p65)兔抗鼠磷酸化單克隆抗體、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)兔抗鼠單克隆抗體、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)兔抗鼠單克隆抗體、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)兔抗鼠單克隆抗體、p-AMPK兔抗鼠單克隆抗體、p-mTOR兔抗鼠單克隆抗體和GAPDH鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司；轉染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；PCR引物、pcDNA3.1-TWIST2質粒由上海生工生物科技有限公司設計、合成；二氧化碳培養箱購自上海力申科學儀器有限公司；Bio-Rad T100熒光定量PCR儀和Bio-Rad iMark酶標儀購自美國BIO-RAD公司；BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司；WST-8、細胞計數試劑盒CCK試劑、細胞凋亡檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；RNA提取試劑盒購自日本Takara公司；AMPK激活劑(A-769662)購自北京百奧萊博科技有限公司；NAD+/NADH檢測試劑盒購自美國Bio Vision公司；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)試劑購自美國Sigma公司。

二、研究方法

1.細胞培養：實驗細胞常規培養于RPMI 1640培養液(含10%胎牛血清及100 U/ml雙抗)，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱，隔天換液，細胞融合至80%～90%時傳代，傳至第三代進行后續實驗。

2.細胞轉染及分組：pcDNA3.1-TWIST2質粒、陰性對照質粒pcDNA3.1及pcDNA3.1-FGF21質粒均由上海生工生物科技有限公司設計、構建。按照Lipofectamine3000說明書將pcDNA3.1-TWIST2質粒、陰性對照pcDNA3.1質粒及pcDNA3.1-FGF21質粒分別轉染至SK-OV-3和HO-8910細胞中，命名為TWIST2組、陰性對照組和FGF21組，空白對照組不轉染任何質粒。置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養48 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉染效率，分別記錄細胞總數及綠色熒光的細胞個數。轉染效率=綠色熒光的細胞數/細胞總數×100。實驗設置3個重復。

3.qRT-PCR：取組織樣本200 mg，加入1 ml Trizol剪碎，加入1/5體積的氯仿，12 000g離心15 min，吸取上層無色水相移入新EP管中，加入等體積的異丙醇，12 000g離心后管底可見微量RNA沉淀，75%乙醇洗一遍，干燥后加入無RNase水溶解沉淀，即為組織總RNA，備用。將SK-OV-3、HO-8910、COC1、A2780四種卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞(IOSE80)分別以1×105個/孔的密度接種于12孔板，培養24 h后吸去上清液，收集細胞，依照RNA提取試劑盒說明書中的方法提取細胞總RNA。然后按照逆轉錄試劑盒說明書的操作方法進行逆轉錄，再以cDNA為模板，進行qRT-PCR，引物序列如表1所示，反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，擴增35個循環。按照2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列及產物長度

4.細胞活力的檢測：pcDNA3.1-TWIST2質粒、陰性對照質粒分別轉染SK-OV-3和HO-8910細胞，以1×105個/孔的密度接種于96孔板中，向培養板中加入不同濃度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)的WST-8，每個濃度設3個復孔并設空白對照，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h；每孔加入20 μl CCK溶液，孵育24 h；酶標儀測定450 nm處的OD值。以上實驗重復3次，取平均值。

5.細胞凋亡率的測定：pcDNA3.1-TWIST2或陰性對照質粒分別轉染SK-OV-3和HO-8910細胞，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h；將細胞以1×105個/孔的密度接種在6孔板中。根據細胞凋亡檢測試劑盒的說明，用冷的PBS將細胞洗滌兩次，然后用細胞凋亡檢測試劑盒中的膜聯蛋白V-FITC/PI染色。細胞凋亡率用流式細胞儀分析。以上實驗重復3次。

6.Western blot檢測蛋白表達量：提取組織和細胞的總蛋白，BCA蛋白質定量檢測試劑盒測定蛋白含量。分別從每個組織和細胞樣品取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上；室溫5%脫脂奶粉封閉1 h，加入用3% BSA按1∶1 000稀釋的TWIST2、GAPDH一抗，按1∶500稀釋的FGF21、p-AMPK、p-mTOR一抗，4℃過夜；二抗按1∶10 000稀釋，室溫孵育2 h，TBST清洗后，ECL顯影，凝膠成像儀拍照(GAPDH為內參)。

7.細胞氧化應激的檢測：將pcDNA3.1-TWIST2、陰性對照質粒分別轉染至SK-OV-3和HO-8910細胞中，用于以下實驗：(1)ROS含量檢測：將各組細胞以1×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養48 h后收集細胞；用濃度為10 μmol/L的DCFH-DA重懸細胞，根據ROS檢測試劑盒說明書操作，37℃避光孵育20 min，棄上清液，PBS清洗3遍，流式細胞儀檢測熒光強度。(2)SOD活性檢測：采用WST-8法檢測SOD活性，將各組細胞以1×105個/孔的密度接種在6孔板中，48 h后收細胞提取蛋白質，按照SOD檢測試劑盒說明書操作，取20 μl樣品，依次加入150 μl WST-8/酶工作液和20 μl反應啟動液，37℃孵育20 min，在波長450 nm處測定吸光度。(3)ATP含量檢測：按照ATP檢測試劑盒說明書配制ATP檢測工作液，各組細胞以1×105個/孔的密度接種在96孔板中，48 h后收細胞提取蛋白質；100 μl檢測工作液中加入50 μl樣本液，37℃避光孵育30 min，波長570 nm處測定吸光度值。(4)NAD+/NADH檢測：按照NAD+/NADH檢測試劑盒配制檢測液，細胞以1×105個/孔的密度接種在96孔板中，48 h后收細胞提取蛋白；將80 μl配置好的樣本液加入檢測液中，37℃避光孵育1 h，在波長460 nm處測定吸光度值。實驗重復3次。

三、統計學處理

結 果

一、熒光顯微鏡和qRT-PCR檢測轉染情況

TWIST2組、陰性對照組和FGF21組的SK-OV-3和HO-8910細胞培養了48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的細胞，轉染效率均在50%以上，空白對照組未見綠色熒光(圖1)。

qRT-PCR檢測結果顯示，pcDNA3.1-TWIST2質粒轉染SK-OV-3和HO-8910細胞后，TWIST2組的TWIST2 mRNA表達量均顯著高于空白對照組與陰性對照組(P<0.01)。pcDNA3.1-FGF21質粒轉染SK-OV-3和HO-8910細胞后，FGF21組的FGF21 mRNA表達量均顯著高于空白對照組與陰性對照組(P<0.01)(圖2)。

A、E：空白對照組；B、F：陰性對照組；C、G：TWIST2組；D、H：FGF21組圖1 熒光顯微鏡下觀察質粒轉染效率

A：TWIST2 mRNA表達水平；B：FGF21 mRNA表達水平。與TWIST2組或FGF21組比較，*P<0.01圖2 各組細胞中TWIST2與FGF21的mRNA表達水平

二、TWIST2在卵巢癌組織和卵巢癌細胞中的表達

利用qRT-PCR和Western blot實驗檢測組織和細胞中TWIST2的表達量。結果顯示，TWIST2在卵巢癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織(P<0.05)(圖3)。TWIST2在SK-OV-3、HO-8910、COC1和A2780卵巢癌細胞中的表達量均顯著低于人正常卵巢上皮細胞中的表達量(P<0.05)(圖4)。

三、TWIST2對卵巢癌細胞SK-OV-3和HO-8910凋亡的影響

在SK-OV-3和HO-8910細胞中分別轉染pcDNA3.1-TWIST2質粒或陰性對照質粒后，檢測細胞活力及細胞凋亡情況。結果顯示，與空白對照組相比，TWIST2 組細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著提高(P<0.05)(圖5)。

A：TWIST2 mRNA的表達量；B：TWIST2 蛋白的表達量。與癌旁組織比較，*P<0.05圖3 TWIST2在卵巢癌組織和癌旁組織中mRNA和蛋白表達水平

A：TWIST2 mRNA的表達量；B：TWIST2蛋白的表達量。與正常卵巢上皮細胞比較，*P<0.05圖4 TWIST2在正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞中mRNA和蛋白質的表達水平

A：卵巢癌細胞活力比較；B：卵巢癌細胞凋亡率比較。與TWIST2組比較，*P<0.05。C：流式細胞儀檢測卵巢癌細胞凋亡圖5 TWIST2對SK-OV-3和HO-8910兩種卵巢癌細胞的細胞活力與細胞凋亡率的影響

與空白對照組相比，TWIST2組凋亡蛋白caspase-3、促凋亡蛋白Bax的表達量顯著增加(P<0.05)，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量顯著降低，因此Bax/Bcl-2的比值顯著增大(P<0.05)(圖6)。以上結果說明TWIST2促進SK-OV-3和HO-8910細胞的凋亡。

A：caspase-3蛋白表達量；B：Bax/Bcl-2比值。與TWIST2組比較，*P<0.05。C：Western blot檢測caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白條帶圖圖6 TWIST2對SK-OV-3和HO-8910兩種卵巢癌細胞中caspase-3蛋白表達量和Bax/Bcl-2比值的影響

四、TWIST2對卵巢癌細胞SK-OV-3和HO-8910氧化應激的影響

SK-OV-3和HO-8910細胞中分別轉染pcDNA3.1-TWIST2質粒或陰性對照質粒后，檢測不同處理組細胞內氧化應激相關因子的水平。結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，TWIST2組ROS水平顯著增加(P<0.05)，NAD+/NADH及ATP水平顯著降低(P<0.05)；SOD的酶活力顯著降低(P<0.05)(圖7)。以上結果說明TWIST2對SK-OV-3和HO-8910細胞的氧化應激起到促進作用。

五、TWIST2對FGF21及AMPK/mTOR通路相關蛋白的影響

在SK-OV-3細胞中分別轉染pcDNA3.1-TWIST2質粒或陰性對照質粒后檢測FGF21、p-AMPK和p-mTOR的蛋白表達量。結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，TWIST2組中FGF21、p-AMPK、p-mTOR蛋白的表達量顯著降低(P均<0.05)(圖8)。

A：ROS水平比較；B：NAD+/NADH水平比較；C：ATP水平比較；D：SOD活力比較。與TWIST2組比較，*P<0.05圖7 TWIST2對SK-OV-3和HO-8910兩種卵巢癌細胞氧化應激水平的影響

A：Western blot檢測FGF21、p-AMPK和p-mTOR蛋白的條帶圖；B：FGF21蛋白表達量；C：p-AMPK蛋白表達量；D：p-mTOR蛋白表達量。與TWIST2組比較，*P<0.05圖8 TWIST2對卵巢癌細胞SK-OV-3中FGF21、p-AMPK和p-mTOR蛋白表達量的影響

進一步研究發現，FGF21在卵巢癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織中的表達量(P<0.05)，且FGF21與TWIST2在卵巢癌組織中的表達量呈顯著的負相關關系(r=-0.625 4，P<0.01)(圖9)。以上結果說明TWIST2可以抑制FGF21的表達，抑制AMPK/mTOR通路的激活。

六、FGF21介導的AMPK/mTOR通路參與TWIST2對卵巢癌細胞的作用機制

為了進一步探究TWIST2對卵巢癌細胞作用的分子機制，在SK-OV-3細胞中分別轉染pcDNA3.1-TWIST2質粒、pcDNA3.1-FGF21質粒或AMPK激活劑(A-769662)，檢測不同處理組的細胞凋亡和細胞氧化應激情況。結果顯示，與TWIST2組比較，轉染FGF21質粒及AMPK激活劑后p-AMPK、p-mTOR蛋白表達顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率和ROS的水平顯著降低(P<0.05)，逆轉了TWIST2的抑制作用(圖10)。以上結果表明FGF21介導的AMPK/mTOR通路參與TWIST2對卵巢癌細胞的作用途徑。

A：FGF21蛋白表達水平；與癌旁組織比較，*P<0.05。B：TWIST2和FGF21的相關性圖9 卵巢癌組織中FGF21蛋白表達水平及FGF21與TWIST2的相關性

A：Western blot檢測p-AMPK、p-mTOR的蛋白條帶圖；B：p-AMPK蛋白表達水平；C：p-mTOR蛋白表達水平；D：卵巢癌細胞凋亡率；E：ROS水平變化。與空白對照組比較，*P<0.05；與TWIST2組比較，#P<0.05圖10 FGF21和AMPK激活劑對TWIST2組氧化應激水平和凋亡率的影響

討 論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[11]。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最多見，其次是惡性生殖細胞腫瘤。卵巢上皮癌死亡率居各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴重威脅[12]。由于卵巢位于盆腔深處、體積小，發生病變時缺乏典型臨床癥狀，所以很難早期發現。卵巢上皮癌患者手術中局限于原發灶的病例較少，大多數病例的癌細胞已擴散到盆腹腔各個器官，所以早期診斷卵巢上皮癌是臨床難題之一，對卵巢上皮癌進行更深層次的研究報道越來越多。

許多研究發現TWIST2在腫瘤轉移過程中發揮了核心作用，其主要通過影響上皮間質轉化(EMT)相關蛋白表達從而改變腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[13]。TWIST2在腫瘤發生中有雙重作用，該蛋白在多種人類腫瘤中均有高表達，具有致瘤作用，但在某些腫瘤中表達降低，具有抑瘤作用[14]。但是，TWIST2在卵巢癌中的報道較少，尤其是對TWIST2在腫瘤中所參與的信號通路和分子機制的研究較少。2016年Zhang等[15]研究發現，TWIST2通過調控細胞外基質(ECM)受體相互作用途徑中整合素α6(ITGA6)和整合跨膜糖蛋白44(CD44)的表達，促進了腎癌細胞的增殖和侵襲，且與國際婦產科學聯合會(FIGO)確定的腎癌分期和淋巴結轉移程度呈正相關。此外，相比于TWIST1，抑制TWIST2其表達后可以顯著上調E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)表達同時下調N-Cadherin表達，進而抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力[16]。然而，TWIST2對癌癥淋巴結轉移的分子調控機制和信號通路，仍有待進一步探索。與上述結論一致的是，本研究發現，TWIST2可以顯著抑制卵巢癌細胞的增殖，并誘導細胞氧化應激，促進細胞凋亡，說明TWIST2在人類卵巢癌的發生發展過程中發揮重要作用。

FGF21是FGF家族中的一員，是一種主要介導糖脂代謝的內分泌因子，在維持葡萄糖穩態、保護肝臟、心臟、腎臟和皮膚免受損害以及癌細胞生長方面發揮關鍵作用[17]。近年來，有證據表明FGF21在抗衰老過程中起著關鍵作用，FGF21治療方案可改善多種與年齡相關的代謝性疾病的進程，包括肥胖、2型糖尿病、癌癥、腎臟和心血管疾病等[18]。且過表達FGF21的轉基因小鼠壽命比正常小鼠顯著延長[19]。此外，FGF21通過調節沉默信息調節因子1(SIRT1)水平延緩內皮細胞的復制衰老[20]。FGF21還可以通過調節線粒體的生物發生，抑制血管緊張素誘導的人類大腦血管平滑肌細胞衰老[21]。然而FGF21在癌癥發展過程中的研究報道較少。有研究發現，甲狀腺癌患者組織中FGF21水平與癌癥分期呈正相關，且與復發顯著相關，重組FGF21可以通過激活癌細胞中的FGFR信號軸和EMT信號導致腫瘤具有侵襲性[22]。在本研究中，我們深入探討了FGF21在卵巢癌中的表達水平和作用，結果發現FGF21在卵巢癌組織中表達量顯著增加，且可以保護卵巢癌細胞免受氧化應激，降低卵巢癌細胞的凋亡率，發揮促癌作用。

在本研究中，TWIST2在卵巢癌組織和卵巢癌細胞中的表達量均顯著低于癌旁組織和正常卵巢上皮細胞的表達量；過表達TWIST2可以顯著促進卵巢癌細胞內的氧化應激并誘導卵巢癌細胞凋亡；此外，過表達TWIST2可以抑制FGF21蛋白及AMPK/mTOR通路相關蛋白的表達；進一步的研究結果表明FGF21介導的AMPK/mTOR通路參與TWIST2對卵巢癌細胞的作用途徑。

綜上所述，本研究證明TWIST2能夠促進卵巢癌細胞氧化應激和凋亡，其作用機制是通過調控FGF21介導的AMPK/mTOR通路來實現的，這為臨床上卵巢癌的診斷和治療提供了理論依據。