miR-15b-5p對大鼠的胰腺外分泌細胞 AR42J凋亡的影響

王福貴　王小蝶　余維麗　孫昀

摘要 目的 研究小的非編碼RNA（miRNAs）miR-15b-5p對在雨蛙素處理下的大鼠胰腺外分泌細胞AR42J細胞凋亡的影響。方法? 在體外利用雨蛙素誘導AR42J細胞創建胰腺炎模型 ，并利用qRT-PCR和Western blot測定使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后細胞內Caspase-3及Caspase-9的mRNA和蛋白質相對表達水平;采用流式細胞術來測定各組細胞的凋亡狀況。結果? 在使用miR-15b-5p inhibitor后，細胞凋亡有關基因組中Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達水平和蛋白質相對表達量減少，而細胞凋亡率相對降低（P<0.05）;而使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達水平和蛋白質相對表達量上升，細胞的凋亡率升高（P<0.05）。結論? miR-15b-5p inhibitor能夠減少由雨蛙素所誘發的胰腺外分泌細胞凋亡，表明它可能是防治急性胰腺炎有效的潛在靶點。

關鍵詞：miR-15b-5p;AR42J細胞;急性胰腺炎;細胞凋亡。

中圖分類號 R 34

急性胰腺炎（Acute pancreatitis， AP）是一種典型的胃腸疾病，以胰腺外分泌細胞中胰蛋白酶原的特異活化以及隨后胰臟的自我消化過程為特征，引起胰臟腺泡損傷、強烈的全身性炎癥反應和多器官衰竭。胰臟炎癥及腺泡細胞的壞死和凋亡是AP主要的病變特征。雖然AP檢查和處理技術目前已經有所提高，但大約20%的胰腺炎病人仍可發展為中度至重癥急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP），SAP發病迅速，其病人死亡比例可高達30%。所以對AP發病機制有更準確的認識，對開發更好的治療措施至關重要。

MicroRNA（miRNA）是一類內源性、高度保守、單鏈非編碼RNA，可以通過識別并于靶基因的非轉錄3'-非轉錄區域（3' UTR）互補和配對，進而導致靶基因分解或翻譯過程的調控。大量的科學研究也已證明，miRNA在細胞發育、分化、增殖、凋亡等多種生物活動中發揮著調節作用。miR-15b-5p是一個成熟的miRNA，剪切于pro-mir-15b的5'端，位于3號染色體長臂。已知mir-15b-5p在帕金森、直腸癌等中上調，而在甲狀腺瘤和糖尿病腎病中低表達。然而，mir-15b-5p在AP中的生物學功能及其機制尚不清楚。

研究擬探討miR-15b-5p在大鼠胰腺外分泌細胞AR42J細胞凋亡中的作用機制，以期為研究AP發病機制和臨床診斷提供新的理論研究和思路。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料

大鼠腺胰腺外分泌細胞AR42J購于上海富衡細胞庫。miR-15b-5p的inhibitor和mimics及陰性對照均購于新貝（上海）生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Life Technology公司。Opti-MEM（x1）培養基購買于美國Gibco公司。雨蛙素干粉購買于北京索萊寶科技有限公司;qRT-PCR試劑盒購買于日本Takara公司。Caspase-3、Caspase-9及 β-Actin抗體均購于武漢三鷹生物技術有限公司。Annexin-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購于上海七海復泰生物科技有限公司。

1.2 細胞復蘇、培養與轉染

預熱含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，從液氮罐中拿出凍存有AR42J細胞的凍存管，于水浴鍋內完全溶解，在無菌操作臺內，用1ml含10%胎牛血清的培養基重懸細胞，將細胞種于培養瓶內，放置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。每2-3天進行一次細胞傳代。待其生長至對數生長期時，將用胰酶消化液（0.25%胰酶）消化重懸好的細胞直接接種于六孔板中，使細胞生長至60%-80%匯合度后，于避光條件下使用Lipofectamine 2000試劑進行細胞轉染24小時。分別記為：A： 空白對照組（不做任何處理的AR42J細胞）、B： miR-15b-5p mimics NC組 、 C： miR-15b-5p mimics組、D： miR-15b-5p inhibitor組、F： miR-15b-5p inhibitor NC組。

1.3 qRT-PCR測定各組細胞中miR-15b-5p miRNA相對表達水平

取出轉染好的所有組細胞，用TRIzol試劑提取出細胞中的全部RNA。用紫外線分光光度計檢測miRNA濃度和純度，合格后進行逆轉錄，轉錄反應條件：25℃、5min，50℃、15min，85℃、5s。合成cDNA以預備使用。按照表1中所示引物序列，采用熒光定量PCR擴增儀，根據以下要求完成熒光定量PCR反應，即95℃、30s預變性;95℃、5s，60℃、20s，共四十個循環;95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反應結束后，以 U6基因為內參照，計算miR-15b-5p相對表達含量，見圖1。

1.4雨蛙素造模

轉染成功后，用雨蛙素（100 nmol/L）刺激24 h，誘導好的細胞可以進行后續實驗。實驗分為6組，分別記為：空白對照組（不做任何處理的AR42J細胞）、雨蛙素組、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics組、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組。再次測定各組細胞中miR-15b-5p miRNA相對表達水平，計算miR-15b-5p相對表達含量，見圖2。

1.5 qRT-PCR測定各組細胞中細胞凋亡相關基因Caspase-3和Caspase-9 相對mRNA相對表達水平

取出轉染并造模后的各組細胞，使用TRIzol試劑提取出細胞中的全部RNA。用紫外線分光光度計檢測RNA濃度和純度，合格后進行逆轉錄，合成cDNA以預備使用。按照表2中所示引物序列，采用熒光定量PCR擴增儀根據以下要求完成熒光定量PCR反應，即95℃、30s預變性;95℃、5s，60℃、20s，共四十個循環;95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反應結束后，以β-actin基因為內參照，計算Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達含量。見圖3。

1.6Western blot法測定細胞中細胞凋亡關鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的相對表達水平

取出之前處理好的各組細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，同時予以蛋白酶抑制劑抑制蛋白降解，獲得總蛋白質后，用BCA檢測試劑盒完成蛋白定量分析。之后進行凝膠電泳及對應蛋白分子的轉膜。轉膜后，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，慢搖并于室內溫度下封閉PVDF膜約2 h，再用TBST溶液洗滌浸泡3x10 min。在相對應的一抗抗體中4℃孵育過夜。第二天再用TBST沖洗3x10 min，然后在相對應的二抗中孵育條帶1 h左右，最后再用TBST沖洗3x10 min。然后用ECL化學發光底物顯影檢測對應的蛋白質，最后用Image-J處理圖像，以β-Actin為內參計算其蛋白質相對表達量。

1.7流式細胞儀測定各組細胞的凋亡狀況

取已處理好的所有組細胞，加入胰酶（不含EDTA）適度消化，吹離細胞后，予以500 g離心力離心5 min，將細胞收集，并吸去上清，加入1 ml PBS溶液再次洗滌細胞，然后將加入PBS溶液的細胞于500 g離心力下離心5 min，再次吸去上清，再加入400 μl Binding Buffer吹勻細胞，每組加入5 μl 的Annexin V-FITC試劑，在室溫下靜置約15 min，再加入10 μl的PI試劑，避光冰浴靜置5 min。在30 min內，使用CytoFLEX流式細胞儀進行凋亡狀況測定，并用CytEepert軟件進行解析。

1.8統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行分析，數據以±s表示，兩組均數采用t檢驗比較，多組數據之間采用方差分析比較。所有數據至少進行三次獨立實驗。P值< 0.05被認為具有統計學意義。

2.1轉染后miR-15b-5p miRNA相對表達水平

與空白對照組相比較，miR-15b-5p mimics NC組 、miR-15b-5p inhibitor NC組中的miR-15b-5p miRNA相對表達水平無統計學意義;與miR-15b-5p mimics NC組相比，miR-15b-5p mimics組中的miR-15b-5p miRNA相對表達水平增高（F=24.65，P<0.05）;反之，miR-15b-5p inhibitor NC組相比，miR-15b-5p inhibitor組中的miR-15b-5p miRNA相對表達水平降低（F=83.86，P<0.05），見圖1。說明轉染成功。

2.2使用雨蛙素造模后各組中miR-15b-5p miRNA相對表達水平

與空白對照組相比較，雨蛙素組中的miR-15b-5p miRNA表達水平增高（F=21.32，P<0.05）;雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的miR-15b-5p miRNA相對表達水平無統計學意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的miR-15b-5p miRNA相對表達水平增高（F=64.24，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的miR-15b-5p miRNA相對表達水平降低（F=65.73，P<0.05），見圖2。說明使用雨蛙素胰腺炎造模后，miR-15b-5p在胰腺炎細胞中高表達。

2.3使用雨蛙素造模后各組中Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平

與空白對照組相比較，雨蛙素組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達水平增高（F=82.96、41.85，P<0.05）;雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平無統計學意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平增高（F=66.10、18.24，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平降低（F=91.14、6.36，P<0.05），見圖3。說明使用miR-15b-5p inhibitor后，細胞凋亡有關基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平下降，而在使用mimics之后，細胞凋亡有關基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達水平提高。

2.4使用雨蛙素造模后各組中Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達水平

與空白對照組相比較，雨蛙素組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質相對表達水平增高（F=29.70、31.82，P<0.05）;與雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質相對表達無明顯統計學意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質相對表達水平增高（F=20.14、76.98，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質的相對表達水平降低（F=54.01、48.73，P<0.05），見圖4。說明使用miR-15b-5p inhibitor后，細胞凋亡有關基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質相對表達水平下降，而在使用mimics以后，細胞凋亡有關基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質的相對表達水平上升。

2.5使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后各組細胞的凋亡發生率

與空白對照組相較，雨蛙素組中的細胞凋亡發生率增高（F=26.41，P<0.05）;雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的細胞凋亡發生率差異并無統計學意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比較，miR-15b-5p mimics + 雨蛙素組中的細胞凋亡發生率升高（F=34.27，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的細胞凋亡發生率下降（F=76.92，P<0.05），見圖5。說明使用miR-15b-5p inhibitor后，細胞凋亡率發生下降，而在使用mimics以后，細胞凋亡發生率上升。

3討論

在本研究中，我們證明了miR-15b-5p在雨蛙素誘導的胰腺外分泌細胞中高表達，miR-15b-5p inhibitor可以通過抑制Caspase-3和Caspase-9的表達水平，減輕雨蛙素誘導的胰腺外分泌細胞的凋亡。我們的結果為研究雨蛙素誘導的AP凋亡提供了理論依據。

雨蛙素誘導AP是一種成熟的AR42J細胞造模實驗模型。有研究表明，miRNAs可參與調節胰腺外分泌細胞的增殖、活化、凋亡等過程，從而影響AP進展。Shen Yang等證實miR-9 mimics降低AP的炎癥反應和凋亡。Zhang Yongpeng等證明miR-551b-5p參與AP炎癥反應的調控。結合miR-15b-5p在乳腺癌、糖尿病腎病等疾病中發揮著抑制細胞凋亡的作用，我們推測miR-15b-5p在AP中起著調控凋亡的作用。在我們的研究中，我們發現miR-15b-5p的mimics與胰腺外分泌細胞的功能障礙之間具有相關性。雨蛙素處理后的大鼠胰腺外分泌細胞中miR-15b-5p表達上調，結果和早期大鼠動物實驗一致。

另外，越來越多的證據表明胰腺外分泌細胞的死亡可能是AP發病的主要機制。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）則作為一種主要的凋亡蛋白酶，處于細胞凋亡通路的下游，Caspase-3在細胞胞質中以無活性的酶原形態呈現，在細胞產生凋亡信號時，發生裂解并被激活，使細胞走向死亡。在我們的實驗中，通過細胞轉染，成功得到miR-15b-5p inhibitor和miR-15b-5p激活的AR42J細胞株，使用miR-15b-5p inhibitor后，Caspase-3表達水平下降，AR42J細胞凋亡水平下降，使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-3表達水平上升，AR42J細胞凋亡水平上升。miR-15b-5p對Caspase-3表達水平的影響和早期的報道一致。這些結果表明miR-15b-5p可能參與并調控胰腺外分泌細胞的凋亡。

Caspase-3主要通過三個途徑參與細胞凋亡過程，一是線粒體介導的細胞凋亡途徑，二是死亡受體介導途徑，三是細胞毒性T淋巴細胞所介導的顆粒酶B途徑。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（ Caspase-9） 位于凋亡級聯反應上游，并活化下游效應Caspase。在本研究中，我們觀察到，使用miR-15b-5p inhibitor后，Caspase-9的表達水平下降，使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-9的表達水平上升。說明miR-15b-5p可能通過活化Caspase-9激活下游Caspase-3，經由線粒體途徑誘發細胞凋亡。

本研究初步論述了miR-15b-5p在調節胰腺外分泌細胞凋亡方面的分子機制，未來還可繼續研究miR-15b-5p上游及下游靶基因，從而進一步探討miR-15b-5p參與胰腺細胞凋亡的具體機制，以期為AP的疾病診斷和預防提出新的依據。

參考文獻：

[1] Zhang K， Zhang X. MiR-146b-3p protects against AR42J cell injury in cerulein-induced acute pancreatitis model through targeting Anxa2[J]. Open Life Sci， 2021， 16（1）： 255-265.

[2] Gukovskaya A S， Gorelick F S， Groblewski G E， et al. Recent Insights Into the Pathogenic Mechanism of Pancreatitis： Role of Acinar Cell Organelle Disorders[J]. Pancreas， 2019， 48（4）： 459-470.

[3] Bansod S， Godugu C. Nimbolide ameliorates pancreatic inflammation and apoptosis by modulating NF-κB/SIRT1 and apoptosis signaling in acute pancreatitis model[J]. International Immunopharmacology， 2021， 90： 107246.

[4] Sinonquel P， Laleman W， Wilmer A. Advances in acute pancreatitis[J]. Curr Opin Crit Care， 2021， 27（2）： 193-200.

[5] Zou J， Qian J， Fu H， et al. MicroRNA15b5p exerts its tumor repressive role via targeting GDI2： A novel insight into the pathogenesis of thyroid carcinoma[J]. Molecular Medicine rePorTS， 2020， 22（4）： 2723-2732.

[6] Salimi S， Noorbakhsh F， Faghihzadeh S， et al. Expression of miR-15b-5p， miR-21-5p， and SMAD7 in Lung Tissue of Sulfur Mustard-exposed Individuals with Long-term Pulmonary Complications[J]. Iran J Allergy Asthma Immunol， 2019， 18（3）： 332-339.

[7] Zhu J， Xu X， Liang Y， et al. Downregulation of microRNA-15b-5p Targeting the Akt3-Mediated GSK-3beta/beta-Catenin Signaling Pathway Inhibits Cell Apoptosis in Parkinson's Disease[J]. Biomed Res Int， 2021， 2021： 11.

[8] Huang X， Hou Y， Weng X， et al. Diethyldithiocarbamate-copper complex （CuET） inhibits colorectal cancer progression via miR-16-5p and 15b-5p/ALDH1A3/PKM2 axis-mediated aerobic glycolysis pathway[J]. Oncogenesis， 2021， 10（4）： 2-16.

[9] Chang J， Yu Y， Fang Z， et al. Long non-coding RNA CDKN2B-AS1 regulates high glucose-induced human mesangial cell injury via regulating the miR-15b-5p/WNT2B axis[J]. Diabetol Metab Syndr， 2020， 12（1）： 109.

[10] Shen Y， Xue C， You G， et al. miR-9 alleviated the inflammatory response and apoptosis in caerulein-induced acute pancreatitis by regulating FGF10 and the NF-kappaB signaling pathway[J]. Exp Ther Med， 2021， 22（2）： 795.

[11] Zhang Y， Yan L， Han W. Elevated Level of miR-551b-5p is Associated With Inflammation and Disease Progression in Patients With Severe Acute Pancreatitis[J]. Ther Apher Dial， 2018， 22（6）： 649-655.

[12] Wu B， Liu G， Jin Y， et al. miR-15b-5p Promotes Growth and Metastasis in Breast Cancer by Targeting HPSE2[J]. Front Oncol， 2020， 10： 108.

[13] Tsai Y C， Kuo M C， Hung W W， et al. High Glucose Induces Mesangial Cell Apoptosis through miR-15b-5p and Promotes Diabetic Nephropathy by Extracellular Vesicle Delivery[J]. Mol Ther， 2020， 28（3）： 963-974.

[14] 于豐銘， 徐揚. Caspase-3的研究進展[J]. 中國細胞生物學學報， 2020， 42（11）： 2072–2078.

[15] 劉大銳， 李報春， 李懷東. 細胞凋亡核心基因Caspase家族的研究進展[J]. 中國醫藥導刊， 2020， 22（11）： 800-805.

作者簡介：王福貴，男，碩士研究生， E-mail：wfg1994@126.com 電話：18326661901

孫昀：男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：sunyun15@163.com

基金項目：安徽省高校自然科學重點項目基金（編號：KJ2017A183）;安徽醫科大學第二附屬醫院臨床研究培育計劃項目（編號：2020LCZD08）