褪黑素對抑郁大鼠行為學及單胺類神經遞質影響

曾龍平 陳昊然 葛成璞 龐圓君 林山儀

【摘要】 目的：探究褪黑素（MT）對慢性不可預見溫和應激模型（CUMS）抑郁大鼠的行為學及海馬內單胺類神經遞質影響。方法：選取60只健康雄性SD大鼠隨機分為空白組（0.9%氯化鈉溶液）、模型組（0.9%氯化鈉溶液）、氟西汀陽性對照組（氟西汀2.1 mg/kg）、MT低劑量組（MT 10 mg/kg）、MT中劑量組（MT 20 mg/kg）、MT高劑量組（MT 40 mg/kg），每組10只，腹腔注射給藥，連續6周。除空白組外，其余各組均在給藥同時配合CMUS法復制抑郁模型。在第0、14、28、42 d通過大鼠體重變化、糖水偏好實驗（SPT）、曠場實驗（OFT）和強迫游泳實驗（FST）測試大鼠的抑郁行為改變，并通過ELISA法檢測各組大鼠海馬多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）的含量測定其腦內單胺類神經遞質含量。結果：模型組第14、28、42天的體重均低于空白組（P<0.05）。與空白組相比，第28、42天模型組的糖水偏好率、后4 min內運動總路徑、中央運動路徑、后4 min掙扎時間比均降低（P<0.05）。與模型組相比，氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組第28、42天體重、糖水偏好率、后4 min內運動總路徑、中央區運動域路徑、后4 min掙扎時間比均升高（P<0.05）。第42天MT高劑量組體重、糖水偏好率、后4 min內運動總路徑、中央區運動域路徑、后4 min掙扎時間比均高于MT中、低劑量組（P<0.05）。與空白組相比，模型組海馬DA、NE、5-HT含量均下降（P<0.05）;與模型組相比，氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組的DA、NE、5-HT含量均升高（P<0.05）。MT高劑量組的DA、NE、5-HT含量均高于MT中、低劑量組（P<0.05）。結論：MT具有改善抑郁大鼠行為學的作用，作用機制可能與其影響腦內單胺類神經遞質的含量有關，且MT改善抑郁作用可能存在的劑量效應關系。

【關鍵詞】 褪黑素 抑郁癥 行為學 單胺類神經遞質

Influence of Melatonin on Praxeology and Monoamine Neurotransmitters of Depressed Rats/ZENG Longping， CHEN Haoran， GE Chengpu， PANG Yuanjun， LIN Shanyi. //Medical Innovation of China， 2021， 18（34）： 0-043

[Abstract] Objective： To explore the influence of melatonin （MT） on the behavior and monoamine neurotransmitters in depressed rats under hippocampus of chronic unpredictable mild stress model （CUMS）. Method： Sixty healthy male SD rats were randomly divided into blank group （0.9% sodium chloride solution）， model group （0.9% Sodium Chloride Solution）， Fluoxetine positive control group （2.1 mg/kg）， MT low dose group （MT 10 mg/kg）， MT medium dose group （MT 20 mg/kg） and MT high dose group （MT 40 mg/kg）， 10 in each group， intraperitoneal injection for 6 weeks. Except blank group， depression model was replicated in other groups with CMUS method at the same time. At 0， 14， 28 and 42 days， the changes of body weight， sugar water preference test （SPT）， open field test （OFT） and forced swimming test （FST） were used to test the changes of depressive behavior in rats. The contents of dopamine （DA）， norepinephrine （NE） and 5-hydroxytryptamine （5-HT） in hippocampus were determined by ELISA. Result： The body weight on day 14， 28 and 42 of model group were lower than those of blank group （P<0.05）. Compared with blank group， sugar water preference rate， total exercise path in the last 4 min， central exercise path and struggle time ratio in the last 4 min in model group were all decreased on day 28 and 42 （P<0.05）. Compared with model group， the body weight， sugar water preference rate， total movement path in the last 4 min， central movement area path and struggle time in the last 4 min in Fluoxetine positive control group， low， medium and high dose MT groups were increased on day 28 and 42 （P<0.05）. On day 42， the body weight， sugar water preference rate， total movement path in the last 4 min， movement area path in the central region and struggle time ratio in the last 4 min in the MT high dose group were higher than those in the MT medium dose and low dose groups （P<0.05）. Compared with blank group， the contents of DA， NE and 5-HT in hippocampus of model group were decreased （P<0.05）. Compared with model group， the contents of DA， NE and 5-HT in fluoxetine positive control group， MT low， medium and high dose groups were increased （P<0.05）. The contents of DA， NE and 5-HT in MT high dose group were higher than those in MT medium dose and low dose groups （P<0.05）. Conclusion： MT can improve the behavior of depressed rats， and the mechanism of which may has a close correlation with its effect on the content of monoamine neurotransmitters in the brain. There may be a dose effect relationship between MT and depression.

[Key words] Melatonin Depression Praxeology Monoamine neurotransmitters

First-author’s address： Qiqihar Medical University Mental Health Department， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.34.009

抑郁癥是一種嚴重情緒節律障礙性精神疾病，以顯著而持久的心境低落為主要臨床癥狀，其病因復雜，在生化因素可能與5-HT、DA、NE等神經遞質的濃度水平或功能下降有關[1]。現今使用的抗抑郁藥物主要通過調節單胺類神經遞質及受體功能來改善抑郁，雖療效明確，但其具有抗抑郁譜窄、不良反應較多等缺點[2]。褪黑素（MT）是由腦松果體合成分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，具有調節機體晝夜節律、抗氧化、抗炎等功效[3]。近年來有研究表明MT與抑郁癥、精神分裂、帕金森病等神經精神類疾病存在關聯[4]。本課題組通過探究不同劑量褪黑素對CUMS模型抑郁大鼠的行為學影響，測定大鼠海馬內5-HT、DA、NE的含量，初步探究MT的抗抑郁作用，討論其作用機制及劑量效應關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SPF級成年雄性大鼠60只，體重180～220 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。購入后飼養于齊齊哈爾醫學院實驗動物中心，室溫為（22±1）℃、相對濕度為65%～70%、光照周期為12 h/12 h。飼養期間大鼠自由飲水和攝食，適應性飼養7 d。

1.1.2 藥物與試劑 褪黑素（生產廠家：北京索萊寶科技有限公司，規格：5 g，純度：99.8%）;鹽酸氟西汀膠囊（生產廠家：禮來蘇州制藥有限公司，批準文號：國藥準字J20170022，規格：20 mg/粒）;PBS緩沖液由齊齊哈爾醫學院機能實驗室配置;多巴胺ELISA檢測試劑盒（批號：20200929）、5羥色胺ELISA檢測試劑盒（批號：20200929）、去甲腎上腺素ELISA檢測試劑盒（批號：20200929），均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 主要儀器 大鼠行為觀察敞箱、強迫游泳實驗裝置（上海欣軟信息有限公司）;BIO-RAD 680全自動酶標儀（美國BIO-RAD公司）;CPA3245分析天平（德國賽多利斯公司）;3-30K微量高速離心機（德國sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥方法 經過7 d適應性飼養后將大鼠隨機分為空白組、模型組、氟西汀陽性對照組和MT低、中、高劑量組，每組10只。空白組大鼠按照群居飼養，其余各組大鼠均單籠孤養[5]。各組藥物用0.9%氯化鈉溶液配置到所需質量濃度：氟西汀陽性對照組2.1 mg/kg（按人臨床等效劑量，以體表面積換算得到）;MT低、中、高劑量組分別為10.0、20.0、40.0 mg/kg[6];空白對照組與模型組大鼠則給予等量0.9%氯化鈉溶液。各組腹腔注射給藥，給藥體積為10 mL/kg。每天給藥1次，連續給藥42 d。

1.2.2 CUMS模型的建立 除空白組外，各組大鼠在給藥1 h內采用不可預見溫和應激（CUMS）法造模。造模具體方法包括：禁食（24 h）、禁水（24 h）、冰水浴（4℃、6 min）、熱刺激（40℃、10 min）、束縛（3 h）、夾尾（2 min）、潮濕墊料（24 h）、超聲（60 W、3 h）、晝夜顛倒、24 h光照[7]。根據隨機數字表，連續刺激42 d。每天給予1種應激，且每種應激不得連續出現2次。

1.2.3 體重測定 在實驗開始第0、14、28、42天，分別測定每只大鼠的體重改變。

1.2.4 糖水偏好率測定 在實驗開始第0、14、28、42天測定各組大鼠糖水偏好率。先放置兩瓶1%的蔗糖水溶液，24 h之后將其中一瓶換成純水，12 h后調換兩個水瓶位置，再飼養12 h完成糖水適應期。將各組大鼠禁食禁水12 h后，在鼠籠上分別放上1%的蔗糖水溶液與純水，禁食12 h，拿走瓶子，記錄兩個瓶子的液體消耗[8]。計算糖水偏好率=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

1.2.5 曠場實驗 在實驗開始第0、7、14、28、42天，糖水消耗實驗結束2 h后進行曠場實驗。實驗在安靜漆黑的房間內進行。將大鼠置于大鼠行為觀察敞箱中央，由攝像機觀察并記錄大鼠在6 min內的活動狀況，使用動物行為學分析軟件記錄后4 min內大鼠的運動總路程和中央運動路程[9]。每只大鼠測試完成后徹底清潔實驗箱，再進行下一只大鼠的實驗，以免糞便氣味等因素對實驗結果的影響。

1.2.6 強迫游泳實驗 在曠場實驗結束的次日，進行強迫游泳實驗。將各組大鼠依此放入強迫游泳裝置，水溫控制在25 ℃左右，使大鼠強迫游泳6 min，使用動物行為學分析軟件記錄大鼠在后4 min內的掙扎狀態時間和不動漂浮狀態時間，計算每只大鼠的掙扎時間比[10]。每只大鼠進行實驗后應更換強迫游泳裝置內的水，避免糞便氣味等對實驗結果的影響。掙扎時間比=后4 min掙扎時間/4 min。

1.2.7 測定海馬內單胺類神經遞質 在實驗第42天結束行為學實驗后，將小鼠斷頭處死，迅速在冰上剝離大腦海馬，置于組織冷凍管中用液氮快速冷凍，放入-80 ℃冰箱保存。測定遞質前將海馬解凍，加入9倍體積的PBS勻漿，使用超聲組織勻漿器制成10%組織勻漿液，將勻漿液置入離心管中，于4 ℃條件下以3 000 r/min速度離心20 min，靜置后仔細收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟分別測定各組大鼠海馬中DA、5-HT、NE的含量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般情況與體重比較 第14天可觀察到模型組與空白組相比大鼠毛發枯黃、活動明顯減少、精神萎靡，消耗的飼料量下降，出現自殘行為，撕咬自身背部皮膚導致受傷，以上癥狀隨著時間逐漸加重。模型組第14、28、42天的體重均低于空白組（P<0.05）。與模型組相比，氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組大鼠一般情況較好，在籠內活動度高，未有自殘行為，第28、42天體重均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。第42天MT高劑量組體重高于MT中、低劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組糖水偏好率比較 與空白組相比，第28、42天模型組的糖水偏好率均降低，差異均有統計學意義（P<0.05）;第28、42天，與模型組相比，氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組的糖水偏好率均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。第42天MT高劑量組糖水偏好率高于MT中、低劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組曠場實驗結果比較 與空白組相比，第28、42天模型組后4 min內運動總路徑、中央運動路徑均減少（P<0.05）。與模型組相比，第28、42天氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組的后4 min內運動總路徑、中央區運動域路徑均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。第42天MT高劑量組的后4 min內運動總路徑、中央運動路徑均高于MT低、中劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3、4。

2.4 各組強迫游泳實驗結果比較 與空白組對比，第28、42天模型組的后4 min掙扎時間比均降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，第28、42天氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組的后4 min掙扎時間比均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。第42天MT高劑量組的掙扎時間比均較MT低、中劑量組升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表5。

2.5 各組海馬DA、NE、5-HT含量比較 與空白組相比，模型組海馬DA、NE、5-HT含量均下降，差異均有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，氟西汀陽性對照組、MT低、中、高劑量組的DA、NE、5-HT含量均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。MT高劑量組的DA、NE、5-HT含量均高于MT中、低劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表6。

3 討論

單胺假說在抑郁癥的發病機制中已得到較為廣泛的認可，其認為中樞神經系統突觸間隙多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）等單胺類神經遞質濃度水平或功能下降是抑郁癥的生物學基礎，進而認為通過改善突觸間隙神經遞質的水平能達到治療抑郁癥的效果[11]。目前臨床使用的許多抗抑郁藥物亦是基于此假說研發的，但多為單一靶點藥物，本課題組試探究褪黑素（MT）這一作用靶點多、效果溫和而不良反應小的藥物對與大鼠的抗抑郁作用及其機制，并初步研究其劑量效應關系。

現有研究已證明MT與抑郁癥之間關系密切，抑郁癥患者癥狀發作期間，腦內MT含量下降，緩解后再度上升，使用MT或MT受體激動劑可能具有抗抑郁效果[12]。有學者從PKC-IP3信號通路方面，探究褪黑素對大鼠海馬組織氧化應激的保護作用與行為學改變[13];另有研究從褪黑素對清醒睡眠狀態的轉化、特異性誘導睡眠作用上入手，探究其改善大鼠睡眠障礙的作用[14];還有學者通過測定褪黑素對大鼠腦內Aβ、Caspase-3、nNOS、Ca2+含量改變，探究其對腦組織的保護作用[15]。

已有的研究證明MT與腦內DA、NE、5-HT的聯系密切：目前已檢測到MT1受體在海馬多巴胺能系統的表達[16]，由于MT具有抗氧化的功能，可能起到抑制單胺能神經細胞的死亡，保護海馬區單胺神經元的作用，從而提高其突觸間隙含量[17-19];MT具有抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的作用[20-21]，而HPA軸與體內單胺能系統關系密切，皮質醇的增多會抑制單胺類神經遞質的含量，因此MT可能通過抑制HPA軸起到提升中樞神經系統內的DA、NE、5-HT作用;研究已表明，褪黑素能調節海馬神經細胞的晝夜節律問題，使晝夜皮質醇水平恢復節律[22]，其作用機制可能與HPA軸節律的恢復有關[23]。但目前較少有研究討論MT的抗抑郁作用是否與改善神經系統突觸間隙單胺類神經遞質存在關聯。

本研究采用慢性不可預見溫和應激（CUMS）抑郁模型模擬人在社會環境中所可能遭遇的應激情況，與臨床抑郁表現相似，符合發病機制[24]。由于目前研究褪黑素對大鼠抗抑郁的實驗中較少有大劑量的使用（>20 mg/kg），因此在經過前期預實驗后（注射不同劑量褪黑素后觀察大鼠的行為學以及有無不良反應），本課題組使用10、20、40 mg/kg作為濃度梯度，探究較高濃度褪黑素的抗抑郁效果。為探究褪黑素用作抗抑郁藥，在臨床使用的可能性，本研究改進了常規的CMUS觀察法，選擇在造模的同步進行給藥，延長觀察時間，并且每7 d進行一次行為學測定，觀察在使用MT的整個過程中大鼠的行為改變。通過測定糖水偏好、曠場實驗、強迫游泳實驗，從快感缺失、自發活動、絕望狀態三個維度評價大鼠的抑郁狀態[25]。研究發現MT從28 d時已出現顯著的改善抑郁效果，且整體作用平穩，未出現反跳現象。并且在10～40 mg/kg的濃度范圍內，MT對大鼠的抗抑郁作用隨濃度增加而加強，未出現不良反應，提示MT的抗抑郁效果可能存在劑量效應關系。通過對比各組實驗大鼠海馬內的DA、NE、5-HT的含量可知：褪黑素具有改善抑郁大鼠海馬內單胺類神經遞質的作用，在各實驗組中以MT高劑量組的提升作用最大，提示其可能的劑量效應關系。

由于MT靶點的廣泛以及代謝途徑眾多，目前抗抑郁作用機制尚未不十分明確。課題組認為MT抗抑郁效果的多種作用途徑，其最終結果可能與通過改善突觸間隙神經遞質的水平有關，本實驗通過探究MT的抗抑郁效果，證實其與提升海馬內單胺類神經遞質之間的相關性，希望為下一步研究褪黑素抗抑郁作用的分子機制與信號通路提供新思路。

參考文獻

[1]高貴元，黃捷，劉丹，等.抑郁癥的發病機制及抗抑郁藥物的研究進展[J].中國醫藥導報，2021，18（1）：52-55，70.

[2]王真真，張有志，宮澤輝，等.抑郁癥治療的新靶點和新策略[J].中國藥理學與毒理學雜志，2010，24（5）：364-370.

[3]劉艷琴，劉曉，楊謙.褪黑素在神經系統疾病中的應用研究進展[J].中國實用神經疾病雜志，2020，23（19）：1738-1743.

[4] LIU W C， WANG X， ZHANG X， et al.Melatonin Supplementation，a Strategy to Prevent Neurological Diseases through Maintaining Integrity of Blood Brain Barrier in Old People[J].Frontiers in Aging Neuroscience，2017，12（3）：154-156.

[5]凌志峰，羅洪斌，謝楓楓，等.柴胡越鞠湯對CUMS誘導的抑郁癥模型大鼠治療作用及其機制[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（21）：68-76.

[6]張大文，熊華秀，王家芳.褪黑素對慢性不可預知溫和刺激大鼠抑郁樣行為的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2020，36（17）：2675-2678.

[7]尚立芝，毛夢迪，許二平，等.柴胡加龍骨牡蠣湯對抑郁大鼠海馬組織PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（23）：12-19.

[8]王吉菊，劉建，黃旭春，等.養陰舒肝顆粒對肝郁證模型小鼠行為學及腦內單胺類神經遞質的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（1）：47-51.

[9]張聰，盧慧勤，胡楚璇，等.淫羊藿苷對慢性不可預知溫和刺激誘導的大鼠抑郁行為和神經遞質水平的影響[J].中國藥學雜志，2018，53（15）：1280-1284.

[10] DENG Z Y，YUAN Y P，LV L F.Effect of ganoderma spore oil on behavior in depression mice and its neurophysiology mecha-nisms[J].中國藥學雜志，2017，52（15）：1325-1330.

[11]劉振，周寧，劉通，等.基于代謝組學的抑郁癥研究進展[J].中國病理生理雜志，2020，36（12）：2264-2275.

[12] Zlotos D P，Jockers R，Cecon E，et al.MT1 and MT2 melatonin re-ceptors：ligands，models，oligomers，and therapeutic potential[J].J Med Chem，2014，57（8）：3161-3185.

[13]陳宏，梁艷，金穎莉，等.褪黑素對精神分裂癥模型大鼠海馬神經元氧化應激損傷的保護作用[J].溫州醫科大學學報，2020，50（3）：227-231.

[14]駱曉峰，陳韓冰，李靚蕾，等.褪黑素對帕金森病大鼠模型睡眠障礙的影響[J].中國獸醫雜志，2020，56（4）：109-113.

[15]李楠.褪黑素對阿茨海默大鼠腦保護作用的研究[D].鄭州：鄭州大學，2006.

[16] Uz T， Arslan A D， Kurtuncu M，et al.The regional and cellular expression profile of the melatonin receptor MT1 in the central dopaminergic system[J].Brain Res Mol Brain Res，2005，136（1-2）：45-53.

[17] Kraus C，Castrén E，Kasper S，et al.Serotonin and neuroplasticity-Links between molecular，functional and structural pathophysiology in depression[J].Neurosci Biobehav Rev，2017，77：317-326.

[18]葛維維，陳再明，梁胤.褪黑素對神經性皮炎伴睡眠障礙患者血清5-HT、BDNF及睡眠質量的影響[J].現代實用醫學，2021，33（5）：608-610.

[19] Brito-Armas J M，Baekelandt V，Castro-Hernández J R，et al.Melatonin prevents dopaminergic cell loss induced by lentiviral vectors expressing A30P mutant alpha-synuclein[J].Histol Histopathol，2013，28（8）：999-1006.

[20]秦娟娟，劉振華，梁艷，等.5-羥色胺及其受體與抑郁癥[J].國際藥學研究雜志，2012，39（5）：409-413.

[21]陳連洲，李松華，蒲犇.阿立哌唑聯合草酸艾司西酞普蘭對重度抑郁患者多巴胺、5-羥色胺和皮質醇的影響研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2019，24（4）：446-450.

[22]邊云，林晨，馬泊濤，等.外源性褪黑素對情感障礙的情緒調控作用：Meta分析和實驗序貫分析[J].臨床精神醫學雜志，2021，31（4）：283-287.

[23]李春艷，王宇紅，王華，等.抑郁合并失眠對大鼠HPA軸及下丘腦中氨基酸類和單胺類神經遞質的影響[J].中國藥理學通報，2021，37（6）：815-822.

[24]劉慧娟，康樂，留甜甜，等.基于數據挖掘的慢性不可預知溫和刺激抑郁癥動物模型特點分析[J].中藥藥理與臨床，2021，8（25）：1-12.

[25]曲書苑，龐寶興.應激性抑郁動物模型評價方法研究進展[J].實驗動物科學，2019，36（6）：59-63.

（收稿日期：2021-09-07）

基金項目：國家級大學生創新創業項目（202011230006）

①齊齊哈爾醫學院精神衛生學院 黑龍江 齊齊哈爾 161006

通信作者：曾龍平