丹參治療缺血性腦卒中潛在效應機制的網絡藥理學研究

朱德才,張昌林,廖映迪

腦卒中是一種急性腦循環障礙導致的局限性或彌漫性神經功能缺損的腦血管疾病,包括缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)和出血性腦卒中[1]。據2016 年全球疾病負擔研究顯示,腦卒中已成全球第二大死亡原因,患腦卒中人數達8 010 萬人,其中缺血性腦卒中占84.4%[2]。在我國,腦卒中是傷殘調整壽命年增加的主要原因之一[3],腦卒中防控形勢嚴峻,未來隨著我國人口老齡化速度的加快,腦卒中疾病負擔仍可能進一步增加。因此,探索更多積極、有效防治腦卒中發生發展的措施顯得尤為必要。

缺血性腦卒中屬中醫學“中風”的范疇,中風的發病與風、火、痰、虛、瘀等因素密切相關,其中瘀貫穿缺血性腦卒中發病發展的全過程[4]。因此,活血化瘀的法則在中風病的治療中占據相當重要的分量[5]。中藥丹參始載于《神農本草經》,其味苦,性微寒,歸心、肝經,具有活血祛瘀、通經止痛等功效[6]?，F代藥理學研究表明,丹參具有改善血液循環、抗血小板聚集、保護血管內皮細胞、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等多種藥理作用,目前主要用于治療冠心病、心肌梗死、缺血性腦卒中等心腦血管疾病[7-8]。因此,探究中藥丹參治療缺血性腦卒中潛在效應機制,對發揮中醫藥治療缺血性腦卒中的優勢具有重要意義。

網絡藥理學是一門融合了系統生物學、生物信息學及計算機技術等的新興學科,這一概念由Hopkins首次提出,他指出對于多成分、多靶點藥物的研發,需要用系統思維,從網絡層面去分析藥物效應機制[9]。這種從網絡層面闡釋藥物效應機制的方法,是對既往“一藥、一靶、一病”還原論藥物研發模式的有效補充。中藥具有多成分、多靶點、多效應途徑的特征,這與網絡藥理學的思想及研究方法相吻合,由此網絡藥理學很快為中藥研究者所接受并應用在中藥藥理研究中,提出了中藥網絡藥理學的研究策略與路線[10]。本研究基于網絡藥理學分析方法,從系統層面以及分子、蛋白水平揭示丹參治療缺血性腦卒中的潛在效應機制,為中藥丹參的進一步藥理研究和臨床應用提供。

1 資料與方法

1.1 丹參化學成分及成分作用靶標預測 BATMANTCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數據庫具有中藥成分靶標預測、基因功能分析、通路富集分析等諸多功能[11],通過藥物相似性原則,預測中藥成分作用靶標[12]。本研究在BATMAN-TCM 平臺“Cluster name”中輸入中藥丹參的拼音“DANSHEN”,并以P＜0.05、Score cutoff=20 為閾值收集中藥丹參的成分信息及預測成分作用靶標。

1.2 缺血性腦卒中靶標收集 本研究以ischemic stroke,brain ischemia,cerebral infarction,cerebral ischemia 作為缺血性腦卒中的關鍵詞,通過檢索DisGe NET(http://www.disgenet.org)[13]、NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、Human Phenotype Ontology(https://hpo. jax. org/app/)[14]、Gene Cards (https://www.genecards.org/)[15]等數據庫,獲取已知的與缺血性腦卒中相關的靶標,并刪除重復靶標,構建缺血性腦卒中疾病靶標數據庫。

1.3 丹參治療缺血性腦卒中的蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 將丹參成分預測靶標及缺血性腦卒中疾病靶標上傳至Venny 2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線分析工具,獲取兩者共同靶標,繪制Venn 圖。STRING(https://string-db.org/)數據庫是一個在線搜索蛋白質相互作用關系的數據庫,該數據庫收錄大量實驗數據、文獻挖掘數據及生物信息學預測數據等[16]。在本研究中,將丹參成分預測靶標與缺血性腦卒中的共同靶標導入STRING 數據庫,選擇研究對象為“Homo sapiens”,構建丹參治療缺血性腦卒中的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。

1.4 PPI網絡分析 網絡拓撲特征中的度中心性(degree)、介度中心性(betweenness centrality)及緊密度中心性(closeness centrality)是衡量網絡節點重要程度的指標[17]。網絡節點在網絡中的重要性與該指標數值的大小呈正相關。本研究采用Cytoscape3.6.1 軟件中“Network Analyzer”對丹參-缺血性腦卒中靶標PPI 網絡進行網絡拓撲學特征分析,獲取其度中心性、介度中心性及緊密度中心性等網絡拓撲特征值,并以同時滿足大于度中心性、介度中心性和緊密度中心性的中位數作為基準,篩選丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標。

1.5 丹參治療缺血性腦卒中的基因本體(GO)及京都基因和基因百科全書(KEGG)分析 GO 分析廣泛應用于基因功能的注釋,其可提供細胞組分、分子功能及生物學過程等生物學信息[18]。KEGG 是國際上最常用的生物信息學數據庫之一,從分子水平方面為了解生物高級功能及生物系統提供參考信息[19]。DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)數據庫整合了包括GO、KEGG 在內的多個權威數據庫資源,為大規模的基因或蛋白提供生物信息方面的注釋[20]。本研究將丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標上傳DAVID 數據庫,對丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標進行GO 基因功能和KEGG 通路富集分析,并依據P-vaule 值結果排序,以圖表形式展示。

2 結 果

2.1 丹參化學成分及成分靶標預測 通過BATMANTCM 數據庫,獲得中藥丹參化學成分38 個,包括丹參素、丹參酚、丹參酚酸類、丹參酮類、丹參醌類、咖啡酸等化合物(見表1)。通過“藥物相似性”原則,計算并篩選出丹參化學成分的作用靶標,除去重復靶標后,共獲得770 個靶標。對中藥丹參成分作用靶標進行生物信息學分析,以了解靶標基因功能、通路富集以及疾病表型方面信息,圖1 為簡化的中藥丹參“有效成分-靶標-通路-疾病”關聯網絡圖。結果提示中藥丹參可參與環磷酸鳥苷(cGMP)-環磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶(PKG)信號通路、Rap1 信號通路、鈣離子信號通路、催乳素信號通路、甲狀腺激素信號通路、逆行神經信號、刺激型態成形因子信號等。疾病表型方面顯示,中藥丹參對于精神類疾病(焦慮、抑郁)、神經系統疾病(神經變性、腦損傷)、心血管疾病以及婦科相關疾病(痛經、子宮內膜異位)可能具有較好的療效。

表1 丹參化學成分信息匯總表

(續表)

圖1 中藥丹參“有效成分-靶標-通路-疾病”關聯網絡圖

2.2 缺血性腦卒中相關靶標 通過DisGeNET、NCBI、HPO、Gene Cards 數據庫檢索缺血性腦卒中關鍵詞(ischemic stroke、brain ischemia、cerebral infarction、cerebral ischemia),獲取相關靶標,其中DisGeNET中737 個,NCBI-Gene 中642 個,HPO 中67 個,Gene Cards 中296 個,去除重復靶標后,共獲取缺血性腦卒中相關靶標1 216 個。

2.3 丹參治療缺血性腦卒中的PPI 網絡構建及分析 將丹參成分作用靶標及缺血性腦卒中疾病相關靶標上傳至Venny 2.1.0 分析工具,獲得共同靶標205 個,作為丹參治療缺血性腦卒中的候選靶標(見圖2)。將丹參治療缺血性腦卒中的候選靶標上傳至STRING 數據庫,構建丹參治療缺血性腦卒中的PPI 網絡。通過計算PPI 網絡特征值,選取同時滿足度中心性、介度中心性和緊密度中心性3 者中位數的靶標作為丹參治療缺血性腦卒中的關鍵靶標,本研究共獲取關鍵靶標83個。對丹參治療缺血性腦卒中關鍵靶標相互作用網絡進行可視化,節點大小及顏色深度反映該靶標度中心性的值(見圖3)。研究顯示丹參治療缺血性腦卒中與白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、TP53、SRC、白介素1β(IL-1β)、FOS、PTGS2、EDN1、JUN、白介素10(IL-10)等靶標密切相關。

圖2 丹參成分靶標與缺血性腦卒中疾病靶標的Venn 圖

圖3 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標相互作用網絡圖

2.4 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標基因功能及通路富集分析 通過DAVID 數據庫對丹參治療缺血性腦卒中核心靶標進行GO 基因功能及KEGG 通路富集分析,以了解其核心靶標所發揮的生物學功能。研究結果顯示,在生物學過程中,丹參治療缺血性腦卒中與一氧化氮生物合成過程的正調控、對藥物的反應、炎癥反應、細胞增殖的陽性調節、衰老、DNA 模板轉錄正調控、血壓調節、ERK1 和ERK2 級聯的正調節、基因表達正調控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正調節作用等過程相關;其分子功能方面涉及了蛋白質雜化活性、酶結合、細胞因子活性、受體結合、生長因子活性、蛋白結合、轉錄因子結合、蛋白質同源活性、相同蛋白質結合、腎上腺素結合等;在細胞層面其作用部位集中在細胞外間隙、胞外區、細胞膜、細胞表面、神經元投射、細胞膜有機組成部分、細胞膜外側面、溶酶體、蛋白質復合物、細胞質核周區等。詳見圖4。

圖4 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標GO 分類圖

結合KEGG 通路富集分析及文獻研究結果見圖5,丹參治療缺血性腦卒中可能通過以下信號通路發揮作用,包括TNF 信號通路、神經活性配體-受體相互作用、T 細胞受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、環磷酸腺苷(cAMP)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、Toll 樣受體信號通路、Ras信號通路、造血細胞系以及細胞凋亡等,提示丹參治療缺血性腦卒中是通過多途徑效應機制發揮療效的。

圖5 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標KEGG 通路富集圖

3 討 論

中藥丹參在我國得到廣泛的應用,尤其在心腦血管領域,如冠心病、高血壓、急性缺血性腦卒中等[21]。本研究通過BATMAN-TCM 數據庫,共獲得中藥丹參化學成分38 個,其中包括丹參素、丹參酚、丹參酚酸類、丹參酮類、丹參醌類、咖啡酸等化合物。動脈新生和側支循環增加是腦卒中病人恢復再灌注和預后的重要因素。研究表明,丹參素可以增加血管內皮生長因子(VEGF)、基質源性因子-1(SDF-1)、腦源性神經營養因子(BDNF)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達,增加卒中后側支動脈的直徑,促進局部腦血流恢復[22]。丹參酚酸具有較強的血小板凝聚作用,其可降低血液中血栓素B2(TXB2)水平,從而發揮抗積聚作用[23]。此外,研究還表明丹參酚酸B 具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等諸多作用,減輕腦缺血性損傷,改善神經功能缺失癥狀[24]。此外,相關研究也表明丹參酮ⅡA 可通過抑制炎性反應及細胞凋亡發揮神經保護作用,降低腦梗死體積及神經功能缺損評分[25-26]。

網絡拓撲特征分析表明,丹參治療缺血性腦卒中與IL-6、TNF、TP53、SRC、IL-1β、FOS、PTGS2、EDN1、JUN、IL-10 等靶標密切相關。免疫炎癥反應在缺血性腦卒中的發生發展中具有重要作用。IL-6 在急性期炎癥反應中具有重要地位,研究表明,急性缺血性腦卒中發生后,釋放的IL-6 可通過N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的激活,上調內皮素-1(ET-1)和JUN 的表達,介導海馬區神經元的死亡以及腦自動調節能力的受損[27]。腦卒中后IL-6 水平與磁共振彌散加權成像(MR-DWI)中急性損害面積、腦灌注缺損、最終梗死面積等參數密切相關[28],并且IL-6 也與腦卒中病人感染(如肺部感染)呈獨立相關,對預測病人是否發生感染具有參考價值[29]。TNF-α具有活化小膠質細胞,促進黏附及趨化因子表達的作用,進而提高炎性相關細胞的遷移能力,是缺血性腦卒中后神經細胞損傷的關鍵原因之一[30]。此外,動物研究發現,對于TNF 受體基因缺乏小鼠,腦缺血后的腦梗死體積和腦損傷程度均明顯高于野生型小鼠,這一定程度上提示TNF 具有一定的神經保護作用[31]。SRC 是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白質,其可通過氧化還原作用,調節緩激肽、偶聯因子6、血管內皮生長因子等,改變血管的結構和功能,在心腦血管疾病如高血壓、腦卒中中發揮重要作用[32]。IL-1β是重要的炎癥反應細胞因子之一,其可啟動白介素1(IL-1)受體,進而激活核因子κB(NF-κB)、JUK、MAPA 等炎性相關通路,產生IL-6 等促炎細胞因子,造成局部腦組織損傷[33]。

在生物學過程方面,本研究發現丹參治療缺血性腦卒中與一氧化氮生物合成過程的正調控、炎癥反應、衰老、血壓調節、ERK1 和ERK2 級聯的正調節、基因表達正調控等過程相關。近年來,一氧化氮作為一種氣體信號分子逐漸為大家所認識,其主要生理功能包括維持血管張力、減少炎癥反應、維持血栓-溶栓系統平衡以及調節細胞生長等[34]。一氧化氮與腦卒中關系密切,一氧化氮的產生主要來源于誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、神經元型一氧化氮合酶(nNOS)以及eNOS。其中,eNOS 在缺血性腦卒中早期及晚期起著腦保護作用,研究表明,一氧化氮作為一種自由基通過修飾線粒體功能,降低線粒體功能障礙,從而介導缺血再灌注損傷后的細胞保護作用[35]。炎癥反應貫穿缺血性腦卒中的整個過程。腦卒中發生后,病灶組織中損傷或死亡的神經細胞會釋放損傷相關模式分子,進而激活炎癥反應的發生,早期炎癥反應的發生會加重腦腫脹的發生以及氧化應激反應,進而造成繼發性的腦損傷[36]。衰老是腦卒中發生的重要因素之一,研究表明隨著年齡的增長,腦卒中危險因素逐漸增加,并且心血管疾病的風險累積效應也不斷上升,這導致了缺血性腦卒中的發生及發病風險顯著提高[37]。此外,高血壓是導致腦卒中發生的高危因素之一[38],多項研究證實,對腦卒中病人及時進行降壓治療,能明顯降低腦卒中的復發率及血管事件的發生率[39]。

結合相關文獻研究,本研究結果顯示丹參治療缺血性腦卒中可能通過TNF 信號通路、神經活性配體-受體相互作用、T 細胞受體信號通路、cAMP 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體(TLR)信號通路以及細胞凋亡等信號通路發揮療效。TNF-α主要表達于巨噬細胞、自然殺傷細胞、T 細胞以及B 細胞,中樞神經系統中的神經元及膠質細胞也可以表達TNF-α。研究表明,急性缺血性腦卒中病人血清中TNF-α水平會升高,并且與病人神經功能的缺損程度和梗死范圍密切相關[40]。此外,TNF-α 可誘導促炎型小膠質細胞形成,參與了缺血性腦損傷的發生[41]。丹參酚酸B 可抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的過度激活,降低TNF-α的表達,發揮腦保護作用,從而縮小腦梗死面積,并改善神經功能[42]。T 細胞受體在T 細胞功能的發揮和免疫突觸的形成中起著重要作用,其可激活許多信號級聯發生,調節細胞因子的產生、細胞的增殖和分化等。通過比較動脈粥樣硬化、腦梗死、心肌梗死病人中TCR 表達情況,研究者發現體內T 細胞受體信號通路表達下降是其共性的變化,而DNA 甲基化是導致TCR 信號下調的關鍵調節因子[43]。cAMP 是細胞內重要的第二信使之一,其通過激活PKA 信號通路,介導cAMP 反應元件結合蛋白CREB,調節神經元再生突觸的形成,發揮腦保護作用[44]。缺血性腦卒中發生后,MAPK 可被激活,對神經細胞凋亡起著重要作用[45]。抑制MAPK 信號通路,可減少神經細胞凋亡,減輕腦組織損傷[46]。Toll 樣受體是參與非特異性免疫中重要的一類蛋白質分子,研究表明,缺血后小膠質細胞及神經元細胞中TLR2 的表達升高,而敲除TLR2 基因后的小鼠則神經細胞的損傷減輕,并且白細胞及小膠質細胞的浸潤亦減少[47]。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學分析方法,闡述了中藥丹參治療缺血性腦卒中的多成分、多靶點、多途徑的效應機制,為進一步的實驗研究和臨床實踐提供一定參考依據和思路。中藥丹參可通過調控IL-6、TNF、SRC、IL-1β、JUN、IL-10 等關鍵靶標,參與一氧化氮生物合成、炎癥反應、衰老、血壓調節等生物學過程,抑制缺血性腦卒中后神經組織的壞死、凋亡,發揮腦保護作用,改善神經功能;其作用機制涉及TNF 信號通路、cAMP 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路等。然而,本研究尚存在一定的局限性,藥物成分的理化特性以及劑量和煎服法對療效結果的影響未能進一步闡述。因此,本研究結果仍需進一步研究證實。