西洛他唑對海馬神經(jīng)干細胞糖氧剝奪性損傷的影響及其作用機制

李燕宏,丁 鑫,杜 堅,張紅梅

腦梗死又稱缺血性腦卒中,是由各種原因引起的局部腦組織缺血缺氧性壞死,進而產(chǎn)生臨床上對應的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。由于大多數(shù)腦梗死是血栓堵塞腦動脈所致,血小板聚集又是血栓形成的關鍵步驟,因而抗血小板聚集治療一直是治療和預防這類疾病的重要手段[1]。為此,腦梗死病人需要長期服用阿司匹林等抗血小板藥聚集物來預防疾病的發(fā)生。而在腦梗死治療過程中,病人腦組織結構與功能的修復主要依賴于病灶區(qū)的神經(jīng)元再生和血管重建過程[2-4]。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)被認為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生與修復中起著重要作用[3]。那么,這些抗血小板聚集藥物是否能調控NSCs 目前少有報道。磷酸二酯酶3 型抑制劑西洛他唑(cilostazol)作為一種抗血小板藥物,常用于缺血性腦卒中的治療[5]。近年來,有研究顯示,除了抗血小板聚集的作用以外,西洛他唑在減少血管意外事件方面要優(yōu)于阿司匹林[6];單獨應用西洛他唑也能減輕動物模型的腦梗死區(qū)范圍[7]。但是,西洛他唑是否通過調節(jié)NSCs 而介導對腦梗死的保護性作用目前并不清楚。為此,本研究通過小鼠海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷模型,探討西洛他唑對小鼠海馬NSCs 的保護性作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級C57BL/6 小鼠(8 周齡)由成都醫(yī)學院實驗動物中心提供。雌鼠、雄鼠按照2∶1 比例合籠喂養(yǎng),雌鼠交配受孕后自然分娩。取其1 d 齡新生C57BL/6 小鼠,用于海馬NSCs 的分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品及試劑 西洛他唑購自Sigma-Aldrich 公司;抗Nestin(批號:ab105389)、Alexa Fluor 488 熒光標記二抗IgG(批號:ab150077)、抗Bax(批號:ab32503)、抗Bcl-2(批號:ab196495)、抗C/EBP 同源蛋白(CHOP,批號:ab179823)購自Abcam 公司;抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自Santa Cruz公司(批號:sc-25778);抗活化轉錄因子4(activating transcription factor 4,ATF-4)抗體購自Cell Signaling技術公司(批號:11815);ATF-4 siRNA 由銳博生物公司合成,轉染試劑Lipofectamine2000 購自Invitrogen公司;CCK-8 檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司(批號:C0042)。

1.2 海馬NSCs 的分離培養(yǎng)及鑒定 海馬NSCs 的分離培養(yǎng)參照文獻[8]提供的方法。取新生C57BL/6幼鼠(1 d 齡),經(jīng)5%乙醇浸泡消毒,在超凈工作臺內(nèi)斷頭取腦,小心分離海馬組織,剪碎后加入0.25%胰酶于37 ℃消化15 min,采用DMEM 培養(yǎng)基終止消化,低速離心(1 500 r/min)后吸去上清液,沉淀細胞經(jīng)DMEM 培養(yǎng)基重懸,200 目細胞濾網(wǎng)過濾,再次離心并棄上清,用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,調整細胞濃度以1×109個/ L 密度接種于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 更換培養(yǎng)液1 次,每6～7 d 傳代培養(yǎng)。給藥前,取第3 代NSCs 接種于六孔板中培養(yǎng),接種密度1.0×106個/孔。待細胞融合度達到80%時,即用于藥物處理。

為了鑒定NSCs,部分NSCs 接種于六孔板中,貼壁培養(yǎng)4 h 后吸去培養(yǎng)基,加4%多聚甲醛固定,0.3%Triton-100 通透細胞膜,山羊血清封閉,加稀釋比1∶100的抗Nestin 抗體于4 ℃下孵育過夜,經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗后,再加Alexa Fluor 488 熒光標記二抗IgG 孵育2 h,加4",6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核,封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 糖氧剝奪性損傷模型制作及分組藥物處理 糖氧剝奪性損傷模型制作的簡要過程:待細胞融合度達到80%時,將培養(yǎng)基更換為無糖DMEM 培養(yǎng)基,并將NSCs 置于通1%O2、5%CO2乏氧混合氣體的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

分組處理時,將細胞隨機分為對照組、模型組、西洛他唑組、siRNA 空白對照組、ATF-4 siRNA 組。對照組NSCs 事先不做糖氧剝奪性損傷處理,直接采用正常糖含量的培養(yǎng)基培養(yǎng),在正常氧含量混合氣體的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。其他各組NSCs 預先進行糖氧剝奪處理3 h,隨后其培養(yǎng)液更換為正常糖含量的DMEM 培養(yǎng)基,置于正常氧含量混合氣體的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。為了觀察干擾ATF-4 對NSCs的影響,ATF-4 siRNA 組在接受糖氧剝奪損傷處理之前1 h,培養(yǎng)液即更換為含100 nmol/L ATF-4 siRNA 的DMEM 培養(yǎng)基。而siRNA 空白對照組NSCs 則在糖氧剝奪處理之前1 h開始接受100 nmol/L轉染溶劑lipofectamine 2000 處理。NSCs 轉染ATF-4 siRNA或溶劑lipofectamine 2000 的過程將持續(xù)至糖氧剝奪后24 h。西洛他唑組在糖氧剝奪處理后,其培養(yǎng)液更換為含10μmol/L 西洛他唑的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。西洛他唑劑量參考文獻[9]。藥物處理完畢,即收集細胞樣本進行檢測分析。

另外,在檢測西洛他唑對NSCs 增殖活力影響的劑量效應關系實驗中,西洛他唑組再分為3 個亞組:低劑量西洛他唑組(1 μmol/L)、中劑量西洛他唑組(3μmol/L)、高劑量西洛他唑組(10μmol/L)。

1.4 NSCs 增殖活力檢測 采用CCK-8 法。NSCs 以5.0×103個/孔密度接種于96 孔板,每組6 個復孔。糖氧剝奪和藥物處理過程同上所述。藥物處理過程完成后,各組培養(yǎng)板中每孔置換為新鮮100 μL 培養(yǎng)液,再加入10 μL 的CCK-8 溶液,37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用SynergyH1 多功能酶標儀(美國BioTek 公司)檢測各孔450 nm 處吸光值,以此作為細胞活力指證。

1.5 NSCs 中ATF-4、CHOP、Bax、Bcl-2 表達量檢測 采用免疫印跡(Western Blotting)法。藥物處理過程完成后,各組細胞經(jīng)冷PBS 漂洗2 次,加RIPA 裂解液(碧云天生物技術有限公司)裂解細胞樣本。隨后,裂解混合液經(jīng)4 ℃離心(12 000 r/min)10 min。所收集的蛋白濃度采用BCA 法定量。然后,每泳道加入50 μg 蛋白,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF 膜加5%脫脂牛奶液在室溫下封閉2 h;隨后加一抗(抗ATF-4、抗CHOP、抗Bax、抗Bcl-2、抗GAPDH)4 ℃孵育過夜,漂洗3 次;再加辣根過氧化物酶(HRP)連接的二抗羊抗兔IgG 孵育1 h,再洗脫;加增強型化學發(fā)光試劑,以顯示待測蛋白條帶。蛋白條帶圖像掃描至電腦存儲,利用ImageJ 1.43u 軟件分析各條帶的灰度值。其中,Bax/Bcl-2 蛋白表達量比值(即凋亡指數(shù))用于衡量細胞凋亡程度,比值越高表示凋亡越強。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用Graphpad prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 西洛他唑對糖氧剝奪下海馬NSCs 增殖與凋亡的影響 免疫熒光檢測結果顯示,鏡下可見大多數(shù)細胞染色呈Nestin 陽性的亮綠色,被染色細胞即為NSCs。詳見圖1。

圖1 海馬NSCs 的免疫熒光技術鑒定

CCK-8 法檢測海馬NSCs 增殖活力:與對照組比較,模型組海馬NSCs 增殖活力明顯下降(P＜0.01);與模型組、低劑量西洛他唑組比較,中劑量西洛他唑組、高劑量西洛他唑組海馬NSCs 的增殖活力明顯提高(P＜0.01)。根據(jù)NSCs 增殖活力實驗研究結果,本研究后續(xù)實驗中只選取高劑量(10 μmol/L)西洛他唑作為藥物治療組。Western Blot 檢測Bax/Bcl-2 表達:與對照組比較,模型組Bax/Bcl-2 明顯增加(P＜0.01);與模型組比較,中劑量西洛他唑組、高劑量西洛他唑組Bax/Bcl-2 明顯降低(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組海馬NSCs 增殖活力和Bax/Bcl-2 比較(±s)

表1 各組海馬NSCs 增殖活力和Bax/Bcl-2 比較(±s)

與對照組相比,①P ＜0.01;與模型組相比,②P ＜0.01;與低劑量西洛他唑組相比,③P ＜0.01;與siRNA 空白對照組相比,④P ＜0.01。

組別 只數(shù) NSCs 增殖活力 Bax/Bcl-2對照組 10 0.98±0.08 0.64±0.05模型組 10 0.62±0.05① 1.98±0.14①低劑量西洛他唑組 10 0.66±0.05 1.99±0.15中劑量西洛他唑組 10 0.90±0.06②③ 0.98±0.08②③高劑量西洛他唑組 10 0.99±0.08②③ 0.66±0.05②③siRNA 空白對照組 10 0.61±0.04① 1.97±0.14①ATF-4 siRNA 組 10 0.97±0.07④ 0.68±0.05④

2.2 西洛他唑對糖氧剝奪下海馬NSCs 中ATF-4、CHOP 信號通路表達的影響 與對照組比較,模型組海馬NSCs 中ATF-4、CHOP 表達量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較,高劑量西洛他唑組ATF-4、CHOP 表達明顯降低(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組ATF-4/CHOP 信號通路表達比較(±s)

表2 各組ATF-4/CHOP 信號通路表達比較(±s)

與對照組相比,①P ＜0.01;與模型組相比,②P ＜0.01;與siRNA 空白對照組相比,③P ＜0.01。

組別 只數(shù) ATF-4 CHOP對照組 10 0.32±0.02 0.45±0.04模型組 10 0.91±0.06① 1.02±0.07①高劑量西洛他唑組 10 0.34±0.03② 0.47±0.04②siRNA 空白對照組 10 0.90±0.07① 1.05±0.07①ATF-4 siRNA 組 10 0.33±0.03③ 0.48±0.05③

2.3 干擾ATF-4 對糖氧剝奪下海馬NSCs 增殖與凋亡的影響 ATF-4 siRNA 在抑制ATF-4、CHOP 信號通路表達的同時,也明顯升高NSCs 增殖活力(P＜0.01)和降低Bax/Bcl-2(P＜0.01)。詳見表1、表2。

3 討 論

人口老齡化已經(jīng)成為當今全球最為關注的問題之一。隨著老齡化程度的日益加重,各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如腦梗死、阿爾茨海默病、帕金森病等)的發(fā)病率正急劇攀升[10]。NSCs 移植被認為是治療這些疾病的重要手段,主要是因為NSCs 可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生與修復中起著重要作用[11]。內(nèi)源性NSCs 主要定位于海馬齒狀回、室管膜下區(qū)[12]。腦梗死時引起的局部腦組織血流突然終止,可通過糖氧剝奪的方式損傷腦內(nèi)NSCs,使NSCs失去參與神經(jīng)系統(tǒng)再生修復的能力[13]。因此,在腦梗死治療實踐中,務必關注各種治療藥物對腦內(nèi)NSCs功能的影響,注重保護和改善腦內(nèi)NSCs 的功能。為此,本研究觀察常用抗血小板藥西洛他唑對海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷的保護性作用。本研究結果顯示,西洛他唑能通過改善海馬NSCs 的增殖活力和抑制其細胞凋亡過程,從而抑制NSCs 的糖氧剝奪性損傷。因此,西洛他唑可能對維持腦梗死后NSCs 的神經(jīng)再生能力具有一定保護作用。

為了進一步探討西洛他唑保護海馬NSCs 的細胞學機制,本研究探討了ATF-4、CHOP 信號通路與海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷之間的關系,研究結果顯示,糖氧剝奪性損傷可激活海馬NSCs 中的ATF-4、CHOP信號通路;西洛他唑則下調ATF-4、CHOP 信號通路;采用ATF-4 siRNA 干擾抑制ATF-4、CHOP 信號通路,則明顯提升NSCs 增殖活力和降低其細胞凋亡水平。事實上,ATF-4、CHOP 信號通路在心肌細胞[14]、胰腺β細胞[15]、神經(jīng)元[16]等細胞的凋亡過程中都起著重要作用。盡管有實驗證實CHOP 在骨髓間充質干細胞的凋亡中起著重要作用[17],但是ATF-4、CHOP 信號通路在NSCs 凋亡中的作用并不清楚。本研究結果則明確提示,ATF-4、CHOP 信號通路在糖氧剝奪誘導的海馬NSCs 凋亡中起著重要作用,采用ATF-4 siRNA 干擾技術抑制ATF-4、CHOP 信號通路則明顯抑制NSCs糖氧剝奪性凋亡。同時,本研究結果也證實西洛他唑對NSCs 糖氧剝奪性損傷的保護作用與其抑制ATF-4、CHOP 信號通路有關。

綜上所述,本研究結果顯示,糖氧剝奪通過上調ATF-4、CHOP 信號通路而促進海馬NSCs 凋亡,從而影響其參與腦梗死時神經(jīng)再生的能力。西洛他唑則通過抑制ATF-4/CHOP 信號通路,從而抑制NSCs 凋亡和改善海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷。另外,以往研究提示,腦缺血可導致腦組織ATF-4、CHOP 表達上調[18-21]。本研究結果提示,ATF-4、CHOP 信號通路可能是防治腦梗死等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要靶點。