miR-223-3p 和MMP-9 聯合檢測在川崎病冠狀動脈病變早期診斷中的臨床價值

王 麗,趙洋洋,高 燕,高吊清,賈旭林,劉 菲,楊蕊華,陰懷清

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種急性、發熱性血管炎疾病,最常見于5 歲以下的兒童,它能夠影響多個系統,尤其心血管系統,是小兒獲得性心臟病的主要原因,并增加了成年后心肌梗死的風險[1]。KD 主要影響中小血管,易侵犯冠狀動脈,如果不能早期診斷并予以治療,則25%的病人可能會發展為冠狀動脈病變,如冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤、冠狀動脈狹窄甚至猝死[2-3]。基于KD 可能引起對冠狀動脈的損害作用,因此,尋找可靠生物標志物早期發現KD 冠狀動脈損傷,并及時予以治療,以改善病人預后具有重要意義。有研究發現,miRNA 具有強大的生物學功能,在許多生物學過程和疾病(包括KD)中起關鍵作用,其中miR-223-3p 可能與KD 患兒血管內皮細胞損傷有關[4]。近年來,基質金屬蛋白酶(MMP)是一種由多種細胞產生的酶,能夠降解細胞外基質[5-6]。過度表達和激活MMPs 可誘導組織破壞,在多種疾病中起重要作用,包括類風濕關節炎、牙周疾病、癌癥和動脈粥樣硬化[5-7]。MMP-9 是 MMP 家族中的重要成員之一,MMP-9 可能與炎癥性血管病變發生有關,并且可能參與了KD 患兒冠狀動內皮細胞損傷的過程,從而引起了臨床對KD血管損害的重視[8]。本研究檢測KD患兒血清miR-223-3p 和MMP-9 的表達水平,為早期發現KD 合并冠狀動脈病變及病情評估提供可靠的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 KD 組:選取2018 年8 月—2019 年8月于山西省兒童醫院小兒心血管內科收治的KD 患兒80 例。病例納入標準:符合日本KD 研究委員會第四次修訂的診斷標準[9],為急性期的患兒。排除1 周內應用過丙種球蛋白(IVIG)及除外出現IVIG 不良反應等狀況的患兒,排除其他急性發熱出疹性疾病、先天性心臟及血管疾病等,發病年齡為2 個月至7 歲;男58例,女22 例。根據心臟彩超顯示的冠狀動脈病變分級標準[10],將其分為心血管受累組和心血管未受累組。心血管受累組20 例,年齡(1.36±0.81)歲,男12 例,女8 例;心血管未受累組60 例,年齡(1.58±0.65)歲,男42 例,女18 例。對照組:隨機選取我院門診常規體檢的30 名健康兒童(除外先天性心臟及血管疾病),年齡3 個月至8 歲。KD 組與對照組年齡、性別比較差異均無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 標本采集 KD 患兒分別采集入院后且使用藥物治療前和經過IVIG 治療1 周后的血液標本,所有病人采集清晨空腹靜脈血,經EDTA-K2抗凝,離心后(3 000 r/min)的血漿轉入EP 管,保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 儀器與檢測方法 miR-223-3p 檢測采用Real-time法,使用7500 fast 定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀(美國ABI),試劑購自中國吉瑪公司;通過瑞典Anthosht2 酶標儀檢測MMP-9 水平,采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定,試劑盒購自美國R&D 公司。C-反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)和白細胞計數(WBC)使用OLYMPUS 公司生產的生化分析儀AU2700 檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差(±s)表示,不符合正態分布則采用中位數和四分位間距(interquartile range,IQR)表示;計數資料以率表示。計量資料滿足正態分布采用t檢驗或者方差分析;不滿足正態分布則采用基于秩次的非參數檢驗。計數資料采用四格表或者R×C 列聯表χ2檢驗。多因素分析采用非條件Logistic 回歸模型。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3 組急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比較 心血管受累組、心血管未受累組急性期(靜脈注射IVIG 治療前1～10 d)miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 水平均高于對照組,差異均有統計學意義(P＜0.05);心血管受累組急性期miR-223-3p 水平低于心血管未受累組,急性期MMP-9、CRP、ESR、WBC 水平均高于心血管未受累組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3 組急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比較(±s)

表1 3 組急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比較(±s)

與對照組比較,①P ＜0.05;與心血管未受累組比較,②P ＜0.05。

組別 樣本量 miR-223-3p MMP-9(pg/mL) CRP(mg/L) ESR(mm/h) WBC(×109/L)心血管受累組 20 3.21±0.01①② 789.38±94.70①② 48.39±12.59①② 89.34±21.46①② 20.43±8.38①②心血管未受累組 60 4.26±0.01① 280.20±66.18① 26.58±6.44① 24.47±12.52① 15.87±5.47①對照組 30 0.98±0.01 80.40±43.75 0.35±0.01 16.48±5.47 9.48±4.93

2.2 KD 患兒經IVIG 治療前后miR-223-3p、MMP-9水平比較 心血管受累組經IVIG 治療1 周后血漿miR-223-3p 和MMP-9 水平較治療前明顯下降,差異均有統計學意義(P＜0.05);心血管未受累組IVIG 治療前后血漿miR-223-3p水平比較差異無統計學意義(P＞0.05);心血管未受累組IVIG 治療后血漿MMP-9水平較治療前明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 KD 患兒經IVIG 治療前后miR-223-3p、MMP-9 水平比較(±s)

表2 KD 患兒經IVIG 治療前后miR-223-3p、MMP-9 水平比較(±s)

與同組治療前比較,①P ＜0.05。

組別 例數 miR-223-3p MMP-9(pg/mL)治療前 治療后治療前 治療后心血管受累組 20 3.21±0.01 1.39±0.02① 789.38±94.70 205.62±39.43①心血管未受累組 60 4.26±0.01 4.18±0.02 280.20±66.18 110.50±29.28①

3 討 論

近年來,KD 發病率出現逐年升高的趨勢,KD 易累及心血管系統,特別是冠狀動脈,嚴重影響預后,成為成人冠心病的重要危險因素[11]。目前KD 發病機制尚未明確,診斷主要依靠臨床癥狀、體征和心臟超聲及實驗室檢查,但不能早期發現冠狀動脈損傷。探討KD的發病機制并尋找早期反映KD 冠狀動脈損傷的血清學指標,對KD 的臨床診治至關重要。

miRNA 是一類非編碼RNA,通過與靶基因mRNA的3’UTR 或CDS 序列配對,直接或間接地抑制mRNA的翻譯,在許多生理過程中表現出強大的調節作用,包括細胞代謝、增殖、分化和凋亡[12]。miRNA 的異常表達已被證實與人類各種疾病,包括癌癥、心血管疾病和炎性病癥相關[13-14]。有研究報道,骨髓源的miR-223可作為血管內皮細胞的內分泌遺傳信號,能夠進入血管內皮細胞,具有調節其增殖、凋亡等作用[15]。最近的研究表明,miR-223 參與慢性腎臟病(CKD)實驗小鼠動脈粥樣硬化的發展[16]。還有研究發現,miR-223作為胰島素樣生長因子1 的受體,可以促進人臍靜脈內皮細胞凋亡[17]。這均表明miR-223 可能與心血管疾病的發生有關。miR-223-3p 由miR-223 的3"端臂產生[18]。白細胞介素-6(IL-6)被確認為miR-223-3p的靶基因,IL-6 / STST3 信號通路在炎癥反應中起著至關重要的作用[19]。KD 是引起兒童多系統血管炎的重要發熱性疾病,miR-223-3p 很可能參與了KD 引起的血管炎性過程。

KD 是兒童全身性血管炎的最常見原因,全身中小動脈均可受累,其中為心臟提供血液的冠狀動脈最易受累,其病理改變的基礎主要是免疫系統異常激活導致炎性細胞形成透壁性炎性反應,從而導致細胞外基質降解,血管內皮細胞功能紊亂,進一步導致中膜變薄直至彈性內膜的破壞,最終形成冠狀動脈損傷,而上述病理過程均與MMP 家族有關[8]。MMP 是一種由多種細胞類型產生的酶,能夠降解細胞外基質[5-6]。過度表達和激活MMP 可誘導組織破壞,并且還與許多特定疾病(包括類風濕關節炎、牙周疾病、癌癥和動脈粥樣硬化)相關[5-7]。大多數MMP 可以裂解幾種類型的基質成分,并可能降解重疊的底物,例如膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。在MMP 家族中,MMP-2(72 kDa形式)和MMP-9(92 kDa 形式)具有特殊彈性分解活性[20-21]。MMP-9 可能與炎癥性血管疾病發病機制有關,通過降解內部彈性板層,例如巨細胞動脈炎[22]和顳動脈炎[23]。在KD 患兒合并冠狀動脈損傷時血液中MMP-9 增加,可通過損傷內皮間隙彌散至內皮下并被激活,造成基底膜屏障、內皮下彈力纖維層的破壞[8]。

本研究結果顯示,心血管受累組和心血管未受累組急性期miR-223-3p、CRP、ESR、WBC 水平均高于對照組(P＜0.05);心血管受累組急性期CRP、ESR、WBC 水平均高于心血管未受累組(P＜0.05),miR-223-3p水平低于心血管未受累組(P＜0.05),心血管受累組經IVIG 治療1 周后血漿miR-223-3p 水平較治療前明顯下降(P＜0.05),提示miR-223-3p 可早期反映KD冠狀動脈損傷,對血管內皮細胞損傷起到保護作用。

本研究結果顯示,心血管受累組和心血管未受累組急性期MMP-9 水平均高于對照組(P＜0.05);心血管受累組急性期MMP-9 水平高于心血管未受累組(P＜0.05),提示MMP-9 的增高可能在血管炎性損傷尤其是冠狀動脈損傷中發揮重要作用。在使用IVIG 治療后,心血管受累組血清MMP-9 水平雖然較治療前明顯下降,但仍高于對照組,表明KD 患兒治療后雖臨床癥狀改善,但其冠狀動脈的炎性病理損傷過程可能依然存在。

綜上所述,通過對miR-223-3p 與MMP-9 的聯合檢測,發現miR-223-3p、MMP-9 可能與KD 冠狀動脈損傷相關,有望作為識別KD 患兒冠狀動脈早期損傷的指標。