miR-34a在骨肉瘤患者血清中的表達及在診斷和預后中的價值

駱浪，何偉，張磊

(湖北省漢川市人民醫院骨科，湖北 漢川 432300)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種多發于青少年的高度惡性腫瘤，約占原發性骨腫瘤的20%[1]。OS患者臨床表現具有生長快、病程短、易早期發生轉移等特點，導致OS患者的生存率比較低。隨著OS切除手術以及輔助放化療技術的提高，OS患者的生存率得到一定改善，但因缺乏早期敏感與特異性的診斷標記物，使得OS患者一旦發現多已發展到疾病的晚期，導致其復發率與死亡率仍居高不下，據報道晚期OS患者5年生存率僅為20%～30%[2]。因此，積極尋找OS患者高敏感度、高特異性的早期診斷標記物就顯得尤為重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是長度為18～25個堿基序列的內源性非編碼小分子單鏈RNA，其表達量與腫瘤的發生、發展密切相關[3-4]。近年來，研究表明外周血miRNA在OS患者的早期診斷、準確診斷以及微創診斷中具有重要作用[5]。miR-34a作為miRNA家族中的一員，屬于腫瘤家族中常見的抑癌基因。有報道miR-34a在OS患者組織中表達明顯降低[6]，且在體外具有抑制OS細胞快速增殖和轉移的作用[7-8]，但是否在OS患者外周血中表達發生變化還未見相關報道。本研究通過RT-qPCR檢測OS患者外周血中miR-34a表達的變化，分析其表達與患者臨床病理特征以及生存率的關系，探討其在OS患者中的診斷及預后的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性分析湖北省漢川市人民醫院2008年1月至2014年1月收治的OS患者54例，其中男23例，女31例；年齡10～30歲，平均(15.6±2.3)歲。腫瘤發生于股骨遠端21例，脛骨近端28例，肱骨5例。納入標準：入院前未經任何治療；組織病理診斷確診為OS；無其他腫瘤。排除標準：入院前已經接受手術或放化療治療；臨床資料不完整；合并其他腫瘤；無自主行為能力。參考《骨肉瘤臨床循證診療指南》對所有骨肉瘤患者采取治療，同分期患者治療方法無差異。患者出院后，通過電話和復診的方式對患者進行隨訪，隨訪截止時間為2019年4月，總生存時間指患者自第一次治療到卒于該腫瘤的時間(生存者按最后隨訪時間算)。所有患者及家屬簽署知情同意書并自愿配合本實驗研究。選擇同期健康體檢者54例作為正常對照，其中男25例，女29例；年齡10～30歲，平均(16.3±2.1)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本實驗研究已獲得漢川市人民醫院倫理委員會同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本制備 晨起收集所有檢測者靜脈血10 mL，血樣采集后立即放置于無DNA酶和RNA酶的滅菌采血真空管內，自然放置，1 000 g/min，離心5 min，收集血清，將最終獲得的血清置于無RNA酶的Ep管中-80℃保存、備用。

1.2.2 RT-qPCR檢測血清miR-34a 利用TRizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)提取血漿總RNA，使用紫外分光光度計鑒定RNA，參照反轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)生成cDNA，反應條件：65℃ 10 min；25℃ 6 min；冰浴2～5 min；45℃ 30 min；70℃ 10 min。反應產物保存于-20℃下備用。以cDNA為模板通過qPCR擴增，擴增條件：96℃ 18 s；60℃ 20 s；75℃ 15 s，共40個循環。選取U6為內參，所有檢測結果均采用2-ΔCt的方法進行分析。反應中所使用的引物委托寶生物工程有限公司設計合成，其具體序列設計見表1。

2 結 果

2.1 OS患者與健康體檢者血清miR-34a表達的比較 與健康體檢者血清miR-34a表達量(2.21±0.97)相比，OS患者血清miR-34a表達水平(1.17±0.91)明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 血清miR-34a表達對OS的診斷價值 通過ROC評估血清miR-34a是否能夠作為OS診斷的標志物，研究結果發現：曲線下面積(area under curve，AUC)為0.830(95%CI=0.751～0.908，P<0.01)；根據約登指數(cut-off)確定診斷OS的miR-34a臨界閾值即截斷值為1.34，其診斷OS的靈敏度為79.6%、特異性是75.9%(見圖1)。

表1 miR-34a以及內參U6引物序列

圖1 血清miR-34a表達的ROC曲線

2.3 OS患者血清miR-34a表達與臨床病理參數的關系 以中位值0.87為分界點，將OS患者分為血清miR-34a高表達23例和血清miR-34a低表達31例。通過χ2檢驗發現，血清miR-34a表達與腫瘤大小、TNM分期以及是否轉移有關(P<0.05)，與性別、年齡和腫瘤位置無關(P>0.05，見表2)。將血清miR-34a作為因變量，腫瘤大小、TNM分期以及是否轉移作為自變量，進行Logistic回歸分析，結果表明腫瘤是否轉移(P=0.001，OR=0.018)、TNM分期(P=0.021，OR=0.111)是影響miR-34a表達的獨立因素。

表2 單因素分析OS患者血清miR-34a表達與臨床病理特征的關系

2.4 miR-34a表達對OS患者生存率的影響 通過Kaplan-Meier法和log-rank檢驗發現，miR-34a低表達OS患者總生存率明顯低于miR-34a高表達患者，差異具有統計學意義(P=0.003，見圖2)。

圖2 miR-34a表達對OS患者總生存率的影響

3 討 論

OS是一種起源于間葉組織的原發性骨腫瘤，惡性程度非常高。早期如果采取手術聯合放化療治療，其5年生存率接近50%～70%[9]；一旦沒有早期診斷發現，導致其發生轉移，其預后會很差，5年生存率僅為10%[10]。因此，早期發現并診斷OS對其治療和預后就顯得非常重要。OS現階段診斷主要依靠臨床表現的特點以及影像學檢查，但確診還是依賴于病理檢查觀察到的腫瘤細胞形成的骨樣組織[11]。很多OS患者早期臨床表現和影像學檢查并不明顯，因此單純的臨床表現和影像學檢查誤診率高且容易延遲診斷；病理檢查雖然是OS診斷的金標準，但具有創傷性，操作也不方便。因此，臨床上急需尋找到一種早期的、高效的、高敏感度的OS診斷標志物。

miRNA為小非編碼RNA基因產物，在許多腫瘤中出現差異性表達，因此miRNA的表達分析已經成為腫瘤診斷、治療以及預后判斷的重要生物學標志物[12]。miR-34a為miR-34家族中的一員，通常作為一種抑癌miRNA發揮作用，其基因序列位于染色體lp36上，受到經典的抑癌因子P53調控，影響細胞的衰老、凋亡、增殖等[13]。另外，有研究報道miR-34a可以通過下調CDK4、CDK6、E2F3、E2F5、c-Met等基因的表達，發揮其腫瘤抑制的作用[14-16]。因此，在眾多惡性腫瘤中miR-34a表達減少或缺失，如金玲玲等[17]報道在宮頸癌患者血清中miR-34a-5p表達量降低，且在宮頸癌的發生發展過程中起抑制作用；岳會珠等[18]報道乳腺癌組織中miR-34a低表達，并且與患者腫瘤分期、浸潤深度、是否淋巴結轉移以及不良預后有關；李穎等[19]報道肝癌組織中miR-34a表達明顯低于正常肝組織，且腫瘤的惡性程度越高miR-34a的表達就越低。然而，關于miR-34a在OS患者血清中的表達水平以及與OS患者臨床病理特征及生存關系尚未見報道。

血清和血漿中miRNAs檢測正發展成為一類新的潛在生化標志物，用于非侵入性診斷和監測癌癥的發生、發展和預后[20]。相比腫瘤組織標本來講，血標本更易獲取，對人體的傷害較小，并且miRNA在血標本中穩定表達、敏感性和特異性高。因此，血標本中差異表達的miRNA有利于腫瘤的早期診斷、篩查以及指導治療。任慧文等[21]通過骨肉瘤血樣研究提示258個差異表達基因，其中miR99b-5p/miR124表達比可以作為診斷骨肉瘤的生物標志物；馬草源等[22]報道骨肉瘤組織與外周血在miRNA表達上存在相關性和一致性，其中miR-21與miR-29表達的特異性最明顯，可以作為骨肉瘤早期診斷的生物學標志物。本研究通過檢測OS患者血清miR-34a表達，結果發現miR-34a表達水平明顯低于健康者(P<0.01)，說明miR-34a在OS患者血清中呈現低表達，提示miR-34a可能作為抑癌基因參與到OS的發生中，與其在其他腫瘤中的作用相似。ROC曲線是一種常見的評估診斷效能的方法，理想情況下AUC為1.0，此時特異性與敏感性皆為100%；當AUC越接近1.0時診斷效能越高、預測越準[23]。本實驗研究發現通過ROC曲線對血清miR-34a診斷價值進行評估時，AUC為0.830，當診斷OS的miR-34a截斷值為1.34時，其診斷骨肉瘤的靈敏度為79.6%、特異性是75.9%，說明血清miR-34a表達水平是診斷骨肉瘤的潛在生物標志物，具有較高的靈敏性和特異性。單因素與多因素分析血清miR-34a表達水平與臨床病理參數的關系，發現miR-34a表達與腫瘤大小、TNM分期以及是否轉移有關(P<0.05)，而與性別、年齡和腫瘤位置無關(P>0.05)，且腫瘤是否轉移(P=0.001，OR=0.018)和TNM分期(P=0.021，OR=0.111)是影響miR-34a表達的獨立因素，表明腫瘤發生轉移或分期越高，miR-34a表達越低，預后越差；反之預后越好。本研究成果對于OS外周血差異表達基因譜的建立以及OS早期診斷、靶向治療和預后的評估等具有非常重要的意義。但本實驗僅局限于本院OS患者，樣本數量比較少，因此仍需要做大樣本的隨機實驗研究；且miR-34a在OS中的具體作用機制還不清楚，有待于后續實驗的進一步研究。

綜上所述，血清miR-34a水平可作為OS早期診斷、病情進展及預后評估的生物學指標，并有望為OS患者的治療提供新靶點，值得臨床推廣應用。