lncRNA FGD5-AS1調控miR-761影響骨肉瘤細胞增殖、遷移和凋亡的機制研究

李鋒，龔繼承，杜經柱，陳奇

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二八醫院骨科，海南 海口 570206)

骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤，主要表現為骨骼、關節疼痛和局部腫塊，好發于青少年和青壯年[1]。目前，臨床主要依靠手術切除聯合放化療來延長生存期，然而其高復發、高轉移性導致骨肉瘤患者預后較差[2]。據統計，局限性骨肉瘤患者的5年生存率為80%，而轉移性骨肉瘤患者的5年生存率僅為15%～30%[3]。因此，探討骨肉瘤發生、轉移的分子機制對提高骨肉瘤患者的整體生存率具有重要意義。近年研究顯示，除抑癌基因和致癌基因外，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腫瘤生物學中發揮調控因子作用。含有5個PH結構域的反義RNA1(PH domain containing 5 antisense RNA 1，FGD5-AS1)是一種腫瘤相關lncRNA，FGD5-AS1高表達通過抑制其靶微小RNA(microRNA，miRNA)表達可增強結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制細胞凋亡，是結腸癌的潛在治療靶點[4]。生物信息學預測顯示，FGD5-AS1對miR-761具有潛在調控作用。miR-761低表達已被證實與骨肉瘤患者的臨床分期和遠處轉移密切相關，恢復miR-761表達可抑制腫瘤生長和轉移，促進腫瘤細胞凋亡[5]。然而，FGD5-AS1是否靶向miR-761在骨肉瘤中發揮作用尚未可知。本研究以miR-761為切入點，探討FGD5-AS1對骨肉瘤細胞增殖、遷移和凋亡的影響，以期為骨肉瘤治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 組織材料 選取2016—2018年在本院進行手術治療的30例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織和與其對應的瘤旁組織(癌灶周圍3 cm內正常組織)，其中男18例，女12例；年齡7～69歲，平均年齡(20.2±1.29)歲。所有組織樣本均經過病理學檢驗，且樣本收集前所有患者未接受放化療；所有患者未患有其他惡性腫瘤、免疫學疾病、或其他骨關節疾病。

1.2 實驗材料 人骨肉瘤細胞U2OS購自武漢普諾賽生命科技公司；胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液購于美國Gibco公司；Lipofectamine 3000、McCoy 5A培養基購自美國Thermo公司；FGD5-AS1小干擾RNA(si-FGD5-AS1)及其陰性對照(si-NC)、miR-761模擬物(miR-761 mimics)及其陰性對照(miR-NC)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)引物由廣州銳博生物技術公司提供；RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master mix購自大連Takara公司；miRNA分離試劑盒、All-in-One miRNA逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測試劑盒購于深圳欣啟生物科技有限公司；噻唑藍(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)試劑盒、膜聯蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell小室購于美國BD公司；兔源Ki67(ab92742)、上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)(ab40772)、神經鈣黏素(neural cadherin，N-cadherin)(ab76011)和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體以及羊抗兔IgG二抗(ab205718)購于上海艾博抗公司。

1.3 細胞培養和分組 采用McCoy 5A培養基(補充10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗)于二氧化碳體積分數為5%、濕度為70%、37℃恒溫培養箱中培養U2OS細胞。當細胞密度達到80%～90%時，按照1︰2比例進行傳代培養。將對數生長期U2OS細胞分為si-NC組(轉染si-NC)、si-FGD5-AS1組(轉染si-FGD5-AS1)、si-FGD5-AS1+miR-NC組(共轉染si-FGD5-AS1和miR-NC)、si-FGD5-AS1+miR-761組(共轉染si-FGD5-AS1和miR-761 mimics)、si-FGD5-AS1+anti-miR-NC組(共轉染si-FGD5-AS1和anti-miR-NC)和si-FGD5-AS1+anti-miR-761組(共轉染si-FGD5-AS1和anti-miR-761)。

1.4 RT-qPCR檢測FGD5-AS1和miR-761表達 RNA提取試劑盒從骨肉瘤組織、瘤旁組織和各組U2OS細胞中提取總RNA。cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應，利用SYBR Green Master mix進行qPCR反應。以GAPDH作為內源性對照，2-ΔΔCt法檢測FGD5-AS1表達水平。為檢測miR-761表達水平，利用miRNA分離試劑盒提取miRNA，All-in-One miRNART-qPCR檢測試劑盒測定miR-761的表達水平。引物序列如下：FGD5-AS1上游引物5′-CGTGGAGAAGAATTGGGC-3′，下游引物5′-CGTGGAGAAGAATTGGGC-3′；GAPDH上游引物5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′，下游引物5′-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3′；miR-761上游引物5′-ACAGCAGGCACAGAC-3′，下游引物5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5 MTT法檢測細胞活力 將U2OS細胞按照1×104個/孔接種到96孔板，按Lipofectamine 3000使用說明進行細胞轉染，培養48 h后每孔加入20 μL的MTT試劑，培養箱繼續孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min至結晶完全溶解。以空白孔調零后，酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度值(A)。細胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%。

1.6 集落形成實驗檢測細胞克隆能力 轉染48 h后，收集U2OS細胞，吹打制備單細胞懸液。以50、100和200個細胞梯度接種至直徑為6 cm的培養皿，置于細胞培養箱中培養14～21 d，當出現肉眼可見的菌落時，終止培養，棄去細胞懸液。進行多聚甲醛固定和結晶紫染色，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。顯微鏡觀察各組細胞克隆情況，計數>50個細胞的克隆數。

1.7 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 轉染48 h后，收集U2OS細胞，采用McCoy 5A培養基制備單細胞懸液，調整細胞密度為3×104個/mL。取200 μL細胞懸液加入到Transwell上室(未涂有基質膠)，24孔板下室加入500 μL含20%胎牛血清的MEM培養基。培養箱孵育24 h，取出下室，棉簽擦去未過膜細胞，多聚甲醛固定下室膜并進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h后，收集U2OS細胞，采用結合緩沖液調整細胞濃度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液，按照Annexin FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒分別加入Annexin FITC、PI，避光條件下孵育30 min后，流式細胞數檢測細胞凋亡。

1.9 Western blot檢測Ki67、E-cadherin和N-cadherin表達水平 使用RIPA溶液從各轉染組U2OS細胞中提取總蛋白。蛋白樣品煮沸變性后，按照每泳道30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上后，置于含5%脫脂牛奶和0.1%吐溫20的Tris鹽酸緩沖液中封閉2 h。隨后，將膜置于抗Ki67抗體(1︰5 000)、抗E-cadherin抗體(1︰10 000)、抗N-cadherin抗體(1︰5 000)溶液中4℃孵育過夜。然后，將膜置于山羊抗兔IgG二抗溶液(1︰2 000)中孵育2 h。暗室內進行化學發光顯色，以目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

1.10 雙熒光素酶報告基因實驗 含有miR-761結合位點序列的FGD5-AS1野生型熒光素酶報告基因載體(WT-FGD5-AS1)、含有miR-761結合位點突變序列的FGD5-AS1突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-FGD5-AS1)由上海吉瑪制藥公司提供。利用Lipofectamine 3000將miR-NC、miR-761 mimics分別與WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1共轉染至U2OS細胞，48 h后雙熒光素酶報告基因測定系統測定U2OS細胞熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 FGD5-AS1在骨肉瘤中的表達 骨肉瘤組織中FGD5-AS1的表達水平較瘤旁組織顯著升高(P<0.05，見圖1)。

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2 抑制FGD5-AS1對U2OS增殖、遷移的影響 與si-NC組相比，si-FGD5-AS1組的U2OS細胞存活率、克隆形成數、遷移細胞數、增殖相關蛋白Ki67、遷移侵襲相關蛋白N-cadherin表達水平顯著降低，遷移侵襲相關蛋白E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(見圖2和表1)。

2.3 抑制FGD5-AS1表達對U2OS凋亡的影響 與si-NC組相比，si-FGD5-AS1組的U2OS細胞FGD5-AS1表達水平顯著降低，細胞凋亡率及Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05；見圖3～4，見表2)。

2.4 FGD5-AS1靶向miR-761 生物信息學分析顯示，FGD5-AS1與miR-761之間存在部分連續互補的核苷酸序列(見圖5)。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-761 mimics和WT-FGD5-AS1共轉染組U2OS細胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-FGD5-AS1共轉染組顯著降低(P<0.05)，而miR-761 mimics和WT-FGD5-AS1共轉染組U2OS細胞熒光素酶活性與miR-NC和WT-FGD5-AS1共轉染組比較無顯著變化(見表3)。與si-NC組比較，si-FGD5-AS1組U2OS細胞miR-761的表達水平顯著升高[si-FGD5-AS1組(2.24±0.14)，si-NC組(0.97±0.07)，t=24.341，P<0.05]。

2.5 miR-761能增加抑制FGD5-AS1對U2OS增殖、遷移、凋亡的影響 與si-FGD5-AS1+miR-NC組比較，si-FGD5-AS1+miR-761組的U2OS細胞miR-761表達水平顯著升高，細胞存活率、克隆形成數、遷移細胞數、Ki67和N-cadherin蛋白表達水平顯著降低，細胞凋亡率、E-cadherin和Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05；見圖6～7，見表4～5)。

2.6 抑制miR-761能逆轉抑制FGD5-AS1對U2OS增殖、遷移、凋亡的影響 與si-FGD5-AS1+anti-miR-NC組比較，si-FGD5-AS1+anti-miR-761組的U2OS細胞存活率、克隆形成數、遷移細胞數、Ki67和N-cadherin蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率、E-cadherin和Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05；見圖8～9，見表6～7)。

表1 抑制FGD5-AS1對U2OS增殖、遷移及Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響

圖3 抑制FGD5-AS1誘導U2OS凋亡

圖4 抑制FGD5-AS1對U2OS中Caspase-3蛋白的影響

圖5 FGD5-AS1靶向miR-761

表2 抑制FGD5-AS1對U2OS凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖6 miR-761能增強抑制FGD5-AS對U2OS凋亡的誘導作用 圖7 miR-761對抑制FGD5-AS1處理的U2OS中蛋白表達的影響

表4 miR-761能增加抑制FGD5-AS1對U2OS增殖、遷移、凋亡的影響

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin、Caspase-3蛋白的表達

表6 抑制miR-761能逆轉抑制FGD5-AS1對U2OS增殖、遷移、凋亡的影響

表7 Ki67、E-cadherin、N-cadherin、Caspase-3蛋白的表達

3 討 論

骨肉瘤細胞的增殖和向局部區域的遷移侵襲是腫瘤發生、發展的關鍵階段，然而骨肉瘤細胞轉移的分子機制尚不清楚。因此，探討骨肉瘤增殖、遷移的分子機制對識別新的治療靶點、開發新的治療策略意義重大。

FGD5-AS1已被報道在口腔鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、透明腎細胞癌等多種惡性腫瘤中發揮致癌基因作用[6-8]。Fan等[9]研究發現FGD5-AS1在肺癌中表達上調，其通過靶向miR-107上調FGFRL1表達可促進肺癌細胞的增殖。Liu等[6]研究證實FGD5-AS1高表達還可促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。Zhu等[8]通過分析腫瘤基因表達譜發現FGD5-AS1是透明腎細胞癌預后生物標志物和潛在治療靶點。本研究結果顯示，骨肉瘤組織中FGD5-AS1表達較瘤旁組織顯著升高，提示FGD5-AS1高表達可能與骨肉瘤進展有關。功能缺失實驗顯示，轉染FGD5-AS1小干擾RNA進一步抑制FGD5-AS1表達后骨肉瘤U2OS細胞的存活率、克隆形成和遷移能力，細胞凋亡率顯著升高。Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，其表達水平是評價腫瘤細胞增殖情況和惡性程度的重要指標[10-11]。E-cadherin和N-cadherin是鈣依賴性細胞黏附分子，E-cadherin表達增加、N-cadherin表達缺失可維持上皮細胞形態和組織完整性，反之則促進腫瘤細胞的轉移和擴散。研究顯示敲減lncRNA TTTY15通過上調E-cadherin表達、下調N-cadherin表達可降低骨肉瘤細胞的侵襲能力[12-14]。本研究顯示，抑制FGD5-AS1表達后U2OS細胞中Ki67、N-cadherin表達降低，E-cadherin和凋亡執行因子Caspase-3蛋白顯著升高，與功能缺失實驗結果吻合。以上結果表明，FGD5-AS1在骨肉瘤中發揮致癌基因作用。近年來，多項研究表明FGD5-AS1通過靶向miRNA阻礙其功能進而在腫瘤中發揮作用。如FGD5-AS1通過靶向miR-383調控食管鱗癌細胞的生長、遷移、侵襲和凋亡[15]。FGD5-AS1通過與miR-302e相互作用增加結直腸癌細胞惡性增殖、遷移和侵襲能力[4]。本研究通過生物信息學分析篩選發現miR-761可能與FGD5-AS1之間存在相互作用。miR-761位于染色體1p2區域，既往研究表明miR-761在包括骨肉瘤在內的多種惡性腫瘤中具有重要作用[16-17]。Wang等[16]研究發現miR-761通過靶向下調趨化因子受體1(chemokine receptor 1，CXCR1)抑制細胞增殖和侵襲，是骨肉瘤治療潛在標志物。Ren等[18]指出結腸癌組織和細胞系中miR-761表達顯著降低，過表達miR-761可降低結腸癌細胞的生長和遷移能力。然而，Zhang等[19]證實非小細胞肺癌中miR-761表達上調，lncRNA叉頭蛋白F1(forkhead box-F1，FOXF1)相鄰非編碼發育調控RNA通過靶向miR-761則降低非小細胞肺癌細胞的生長和侵襲。本研究通過雙熒光素酶實驗證實FGD5-AS1對miR-761具有負調控作用，此外RT-qPCR檢測顯示抑制FGD5-AS1表達可升高miR-761表達水平。進一步功能分析顯示，過表達miR-761可增強抑制FGD5-AS1對U2OS細胞的增殖、遷移、凋亡以及相關蛋白表達的影響，而抑制miR-761表達則逆轉FGD5-AS1抑制對U2OS細胞的增殖、遷移、凋亡以及相關蛋白表達的影響。以上研究表明，FGD5-AS1/miR-761途徑在骨肉瘤中發揮重要作用，探索miR-761下游靶基因及可能信號通路是下一步研究重點。

圖8 抑制miR-761能逆轉抑制FGD5-AS1對U2OS凋亡的誘導作用 圖9 抑制miR-761能逆轉抑制FGD5-AS1對U2OS中蛋白表達的影響

綜上所述，本研究發現骨肉瘤中lncRNA FGD5-AS1呈高表達，抑制FGD5-AS1通過靶向上調miR-761可降低骨肉瘤細胞的增殖和遷移能力，并誘導細胞凋亡。因此，FGD5-AS1/miR-761途徑可能是骨肉瘤治療的潛在靶點。