凋亡抑制蛋白介導泛素化在惡性黑素瘤發生發展過程中的作用

蔡桂月，鄒銳濤，陳嶸祎 （1.廣東醫科大學，廣東湛江 523023；2.南方醫科大學皮膚病醫院，廣東廣州 510091）

泛素是一個由76 個氨基酸殘基組成的多肽，具有高度保守性，可對蛋白質進行翻譯后修飾，泛素修飾的蛋白質可被蛋白酶體識別并降解，從而改變其定位、影響其活性、促進或干擾蛋白質之間的相互作用[1]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是一類存在于多種組織與細胞中具有抗凋亡活性的蛋白，與多種腫瘤的發生發展、化學耐藥和預后等密切相關。在惡性黑素瘤（MM）中，多種凋亡抑制蛋白家族表達上調，具有RING 結構域的IAPs具有泛素連接酶（E3）活性，通過泛素化過程調節多種在MM發展中起重要作用的蛋白和信號通路參與MM 的發生、發展。本文對IAPs 通過泛素蛋白酶體系統在MM發生發展過程的作用機制作一綜述。

1 泛素化過程在MM發生發展過程中的作用

泛素化是一個調控蛋白質表達的多步驟可逆反應，作為一種蛋白質翻譯后修飾，它在細胞周期、細胞凋亡與DNA 損傷修復等多個胞內反應中發揮作用。異常的泛素化會使胞內生理過程的正常調節發生變化，從而廣泛參與腫瘤的發生發展過程[2]。

泛素化修飾需要泛素活化酶（E1）、泛素結合酶（E2）、泛素連接酶（E3）依次發揮作用。E3 的作用是在泛素化過程中識別底物進行泛素化，決定了泛素化特異性，在包括MM 的多種腫瘤中均檢測到E3 的突變或者表達差異。有研究發現神經前體細胞表達發育下調蛋白4-1(Nedd4-1)基因在MM 中高表達，將其敲除后，細胞內表達同源性磷酸酶-張力蛋白，磷酸化AKT 表達水平下調，導致細胞凋亡增加，表明Nedd4-1 在MM 中可能起癌基因作用[3]。同樣，研究者還發現Nedd4L 基因和Smad 泛素化調節因子2 的表達也可能促進MM 細胞的增殖[4-5]。鼠雙微粒體2(MDM2)作為調節抑癌基因p53 的泛素連接酶，通過泛素化過程降解移入細胞質的p53。在原發MM 中，MDM2 表達水平與腫瘤體積及侵襲性呈正相關[6]，且同時抑制MDM2和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶表達，可以抑制MM 細胞增殖[7]。MDMX 作為MDM2的同源類似物，同樣具有泛素化降解p53的作用,可作為MM 聯合治療的有潛力的靶點之一[8]。最近有文獻報道稱E3 酶RING 也可以靶向p53 使其降解[1]。p27 為另一個重要的抑癌基因，SKP2 的上調通過泛素化降解p27、p57、p21 等抑癌基因，促進細胞生長。研究發現，從黑素細胞到色素痣再逐步發展成為轉移性MM 的過程中，SKP2表達水平逐漸增加，而p27 水平逐漸降低，沉默SKP2 后，MM 細胞的增殖受到抑制[9-10]。泛素化是一個多種酶共同完成的過程，目前關于E3在MM 發生發展過程中的作用研究快速發展，但尚未有成熟的靶向藥物報道。在MM 發生發展過程中，其他異常表達的抑癌基因和癌基因翻譯的蛋白質是否也受泛素化過程調控，需要進一步研究。

2 IAPs的結構與功能

2.1 IAPs的結構特征

IAPs 是一類在細胞內表達結構具有同源性的蛋白分子，目前已發現的人IAPs 家族蛋白包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2、ML-IAP、Survivin、NAIP、ILP-2 和BRUCE。IAPs 結構特征表現為三個結構域：N 末端桿狀病毒IAP 重復子(baculoviral inhibitor of apoptosis repeats，BIR)、C 末端環鋅指結構（ring zine-finger，RING)和Caspase 募集結構域(caspase recruitment domain，CARD)。所有IAPs 家族成員均含有BIR 結構域，BIR 通過與活化Caspase的N 端IBM 結合，在抑制細胞凋亡中發揮關鍵作用。某些IAPs 分子（如c-IAP1、c-IAP2、XIAP、ML-IAP 和ILP-2）C 端包含一個指環結構RING，RING 具有E3 活性，含有RING 結構域的IAPs 分子可以通過泛素蛋白酶體系統使自身或靶蛋白泛素化降解[11]。cIAP-1/2 含有CARD 結構域，此結構位于BIR 與RING 之間，由6 個α 螺旋構成，通過與其他包含此結構的蛋白分子形成寡聚體,調節細胞凋亡。

2.2 IAPs的抗凋亡機制

IAPs 分子主要通過與Caspase 結合，抑制其催化活性阻止細胞凋亡[12]，但各IAPs 家族成員分別介導不同信號通路發揮其抗凋亡功能。研究發現XIAP為最強的Caspase抑制劑，可直接抑制Caspase-3/7/9，阻止細胞凋亡，ML-IAP 分子N 端的BIR 和cIAP-1/2 的BIR2結構域參與調節活化的Caspase-3/7,cIAP-1/2的BIR3 與活化的Caspase-8 結合,阻止Caspase與底物結合,抑制其催化活性[13]。IAPs 亦可通過非Caspase 蛋白依賴途徑抵抗凋亡，如XIAP、NAIP和ML-IAP可激活TAK1/JNK1 信號通路以抵抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導的細胞凋亡，XIAP 還可通過活化TNF-α受體進而激活核因子κB (nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells，NF-κB) 調控抗凋亡基因表達[14]，cIAP-1/2 可與TNF-α 受體相關因子2(TNFa receptor associated factor 2,TRAF2)結合，并且作為E3酶靶向受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein,RIP1)通過TAK1(TGF-beta activated kinase 1)信號途徑激活NF-kB 進而抑制細胞凋亡[15]。

2.3 IAPs在MM組織中的功能

IAPs 最初被認為只對細胞凋亡有抑制作用，但隨著研究的深入，人們發現多種具有RING 結構域的IAPs（包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2、ML-IAP和ILP-2)具有E3活性，并且在細胞遷移、炎癥反應和免疫應答等多方面發揮作用。

有研究者采用cDNA 微陣列研究顯示，在MM 組織中有多種IAPs 家族成員的表達較黑素細胞痣高，包括ML-IAP、cIAP-l、cIAP-2、XIAP 等[16]。后續實驗中，該研究者又采用HIC、CISH 和RT-qPCR 檢測MM和黑素細胞痣組織中的ML-IAP,發現ML-IAP 在惡性黑色素瘤中的陽性率(47.6%～70.6%)明顯高于其在黑素細胞痣中的陽性率(21.4%～25.0%)，提示ML-IAP可能在MM 發生發展中起重要作用，但在原發和轉移性MM 之間，ML-IAP 陽性率無明顯差異，提示MLIAP 在MM 的轉移中作用較小[17]。Mousavi-Shafaei等[18]用寡核苷酸M706 下調ML-IAP 蛋白在MM 細胞中的表達，發現腫瘤細胞對化療敏感性增高。Ayachi等[19]證實XIAP在轉移性黑素瘤和侵襲性黑素瘤細胞系中表達增高，敲除XIAP基因后，MM 細胞的遷移和纖維連接蛋白層表面細胞邊緣的局灶性粘連的形成顯著減少。此外，有研究顯示，IAPs家族成員survivin水平在MM 組織中表達增高,抑制survivin 的表達可以使腫瘤細胞凋亡增加[20]。Zhou 等[21-22]分別研究了ML-IAP 和XIAP 作為免疫原性靶點在MM 中的潛在作用，發現MM 患者對兩者均有較高頻率的免疫應答，且細胞和體液免疫反應與良好的免疫治療效果相關。有趣的是，有研究者發現XIAP、cIAP-1/2 和MLIAP 通過泛素化降解CARF 蛋白激酶促進細胞凋亡，抑制MM 細胞的遷移和侵襲[23]。兩種截然相反的研究結果說明IAPs 可能在MM 發展的不同階段調控不同的分子和信號通路或其自身也被不同分子調控，從而導致這種抑制凋亡或促進凋亡效應的差異性，進一步揭示IAPs 在MM 發生發展中起著舉足輕重的作用。Rac1屬RhoGTP 酶家族，與MM的增殖、侵襲、惡性進展有關，與良性痣皮損比較MM 病灶存在Rac1高表達，且惡性程度高的MM 細胞系Rac1 活性也明顯增高[24]。Oberoi-Khanuja 等[25]發現IAPs 可以發揮E3 酶活性靶向Rac1，使其通過泛素化過程被蛋白酶體降解。IAPs 依賴自身的E3 活性參與MM 細胞凋亡、細胞遷移、炎癥反應和免疫應答等生理過程，但其具體的信號通路和分子機制尚未明了，進一步闡明IAPs 如何調控MM 細胞的增殖、遷移和侵襲，從而影響MM 的發生發展，對MM 患者的治療及預后至關重要。

3 以IAPs為靶點治療MM

目前，MM 的治療包括手術治療、放療和化療等傳統方式以及近十年研究熱點免疫治療和靶向治療，雖然治療方式多樣，但MM 患者生存率仍未得到明顯改善，因此，尋找安全有效的治療靶點成為重要課題。

IAPs 對MM 進展的作用研究結果表明，它們可能是治療干預MM 的有價值的靶點。目前研究人員已開發出多種單價和二價IAPs 拮抗劑，它們能誘導細胞凋亡和/或使癌細胞對其他凋亡誘導療法敏感。這些抑制劑中大多數可以同時抑制多個IAPs 家族成員，稱為泛抑制劑，與之對應的特異性抑制單個IAPs的稱為選擇性抑制劑[26-27]。研究表明選擇性抑制劑對于誘導細胞凋亡的作用有限，提示各個IAPs 家族成員之間可能具有協同作用[28]。單獨抑制survivin 或ML-IAP 在臨床實驗中均未取得良好療效，但利用ML-IAP 具有高度免疫原性的特點，用免疫療法靶向ML-IAP陽性的腫瘤可以改善療效[29]。有研究小組發現使用單鏈反義寡核苷酸靶向XIAP，使之選擇性被拮抗后可能具有一定抗腫瘤活性，然而同時抑制XIAP 和cIAP 可以獲得更好的療效[30-31]。單獨抑制IAPs 可能是其他凋亡誘導方式的促進劑，Enges?ter等[32]用siRANA將XIAP敲低后，MM細胞對凋亡誘導劑TRAIL 誘導凋亡的敏感性增強；Yuan 等[33]發現腫瘤靶向傳遞TNFα和IAPs抑制劑LCL161聯合運用可顯著抑制黑素瘤異種移植小鼠的腫瘤生長和存活，并且比單獨使用兩者中任何一種藥物都更有效。有趣的是，在對具有BRAF 蛋白激酶突變的MM 患者研究中發現，IAPs抑制劑birinapant和TNFα聯合治療在對BRAF 抑制劑具有獲得性耐藥性的黑素瘤細胞中有效，表明IAP 抑制劑對具有耐藥性的患者可能有益[34]。愈來愈多IAPs 抑制劑進入了臨床研究階段，但對于黑素瘤有明顯療效且具有安全性的藥物待進一步研究。我們已經闡述了IAPs 可能在黑素瘤不同階段發揮不同作用，希望能在不久的將來，科研工作者可以揭示出IAPs 隱藏的奧秘，為黑素瘤患者們帶去福音。

4 小結

大量證據表明IAPs 家族成員通過泛素化蛋白酶體系統調控相關蛋白和信號通路，在黑素瘤的發病機制中具有重要作用。通過研究黑素瘤中異常的IAPs表達及泛素化過程，有助于尋找遏制MM 不斷惡化的治療靶點。此外，不管是削弱抑癌基因表達的蛋白質泛素化降解或是加強原癌基因表達的蛋白質泛素化降解都是腫瘤治療中有潛力的研究方向，值得科研工作者進行深入探討。