circRNA-miRNA-mRNA 調控網絡在非小細胞肺癌診斷、預后及治療抵抗中的研究進展

黃家偉，黃 丹，李麗霞，楊志雄（1.廣東醫科大學，廣東湛江 540；.廣東醫科大學附屬醫院腫瘤中心，廣東湛江 54001；.廣東醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東湛江 54001）

肺癌是起源于氣管、支氣管黏膜或者腺體的一種惡性腫瘤，分為兩個組織學類型：非小細胞肺癌(NSCLC,占肺癌的85%)和小細胞肺癌(SCLC)。遺傳及環境因素的共同作用被認為是導致肺癌發生的關鍵。肺癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，診斷時多為晚期(ⅢB-Ⅳ期)[1]。根據2020 年全球癌癥數據，肺癌仍然是癌癥死亡的首要原因，約占死亡病例的18.0%[2]。晚期肺癌預后差，治療手段有限且經濟負擔重[3]。因此深入了解肺癌發生的分子機制，將有助于為其治療提供新的方案。人類基因組中編碼基因僅占2%[4]，剩余的基因大部分為非編碼RNA(ncRNA)[5]。研究者在ncRNA 的基礎上提出了競爭內源性RNA(ceRNA)假說，mRNA、偽基因和lncRNA((Long non-coding RNA)可以通過與microRNA 響應元件(MRE)結合相互調節[5]。隨后的研究亦發現環狀RNA(circRNA)也是ceRNA 的一員[6]。本綜述介紹了ceRNA 網絡中circRNA-miRNA-mRNA 在NSCLC 診斷、治療及預后中的作用。

1 circRNA和miRNA

circRNA 屬于非編碼RNA，于1976 年在RNA 病毒中被首次發現，隨后發現其同樣存在于真核細胞中，并一直被認為是內源性RNA 剪接錯誤的產物[6]。circRNA 和線性mRNA 都是通過剪接前體mRNA(pre-mRNA)產生的，與線性mRNA 使用的典型剪接不同，circRNA 主要通過反向剪接并共價連接3’上游剪接位點和5’下游剪接位點從而形成閉環結構。因此相較于線性RNA，circRNA 對核糖核酸酶(RNase)具有更高的抵抗力，也具有更長的半衰期及更高的穩定性[6]。根據circRNA 的剪接形成模式和組成可以分為9 種類型，其中以外顯子circRNA(Exonic circRNA)、外顯子-內含子circRNA(EIciRNA)和內含子circRNA(ciRNA)最具代表性[7]。隨著研究的深入，發現circRNA 能特異性結合miRNA，參與調控多種疾病的發生、發展[8]。

miRNA也是一種非編碼RNA。人類基因組中包含大量的miRNA 基因，是數量最多的小RNA，約占所有人類基因的15%，其中已被注釋的有2 000 個[9]。大部分miRNA 首先通過RNA 聚合酶Ⅱ轉錄為初級miRNA(pri-miRNA)，在細胞核中被RNase ⅢDrosha進一步切割成前體miRNA (pre-miRNA)，最后經由Exportin 5 轉運至細胞質并由Dicer 切割形成雙鏈miRNA(dsRNA)。成熟的miRNA被裝載到Argonaute蛋白后，促進了RISC 的組裝，隨后與其靶基因的mRNA 3’非翻譯區(3’UTR)特異性結合，起著負調控作用[10]。在調控網絡中，1 個miRNA 可以調控多個mRNA，而1 個mRNA 也可以接受不同的miRNA 調控。據估計，約三分之二的人類編碼基因受miRNA調控[9]。

2 circRNA-miRNA-mRNA調控網絡在NSCLC中的作用

根據ceRNA 假說，當circRNA 與miRNA 具有結合位點時可發生競爭性結合，發揮海綿作用，從而影響miRNA 對靶基因的調控作用。circRNA-miRNAmRNA 調控網絡在多種腫瘤中的作用已有較多的研究報道。在NSCLC中，該調控網絡參與了腫瘤生存、侵襲遷移、耐藥等多種生物過程。

2.1 circRNA-miRNA-mRNA 網絡在NSCLC 診斷和預后中的應用

circRNA 是一種閉環結構的RNA，對RNase 具有抵抗力，同時這種穩定性使它具有參與疾病診斷的潛力[6]。Zhang等[11]在NSCLC組織及細胞系中發現circ-SATB2 高表達，而circSATB2 可通過海綿miR-326 上調靶基因FSCN1(Fascin Actin-Bundling Protein 1)的表達，以促進細胞增殖、遷移和入侵。此外circSATB2還可以通過外泌體參與細胞間傳遞并影響受體細胞的功能。在另一項研究中，Liu 等[12]根據肺癌組織中circ_0046264 表達水平進行生存分析發現，低表達組患者的生存期明顯長于circ_0046264 高表達組。在患者的腫瘤組織和血清中，circ_0046264 的者操作特性(ROC)曲線下面積分別為0.971 和0.915，特異性為0.973和0.957，敏感性為0.951和0.927，約登指數分別為0.924 和0.884。此外，Tan 等[13]發現F-circEA 是由EML4-ALK(EMAP Like 4-ALK Receptor Tyrosine Kinase)融合基因反向剪切產生，并且特異地存在于EML4-ALK 陽性NSCLC 患者血漿中。上述這些研究表明circRNA 可在外周血循環中穩定存在并具有進行檢測的可能性，而且它在NSCLC 組織及外周循環中具有相近的診斷效率，以及良好的特異性和敏感性，具有一定的實際應用價值。另外，外周特定circRNA 的出現及表達變化還可反映腫瘤細胞內相應基因的改變，這將有助于疾病的診斷及治療。

circRNA 的表達水平變化也與NSCLC 的臨床預后相關。circ_0021205 在NSCLC 組織及細胞系中表達上調，并與腫瘤大小、淋巴結擴散和遠處轉移呈正相關。在體外研究中發現circ_0021205通過海綿miRNA-16-5p 上調VEGFA(vascular endothelial growth factor A)表達水平以促進NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。Chen 等[15]通過在線微陣列數據集發現circ_100395 在NSCLC 中低表達，并在69 對肺癌組織和非腫瘤組織中得到進一步驗證。circ_100395 表達水平與腫瘤的TNM(腫瘤大小、淋巴結、遠處轉移)分期及預后呈負相關。在體外研究中發現，circ_100395 可以通過調節miR-1228/TCF21(transcription factor 21)信號軸抑制NSCLC 細胞的生存和侵襲遷移，并在異位移植實驗中得到驗證。Han等[16]發現circ-BANP的高表達與肺癌患者的低存活率相關，在機制上circ-BANP介導miR-503/LARP1(La Ribonucleoprotein Domain Family Member 1)信號軸促進NSCLC 細胞的生長和遷移。circ-FOXM1 和circ_0003645 也被發現在NSCLC組織中表達上調，并與淋巴結擴散、較晚的TNM 分期及預后密切相關[17-18]。而circ-RAD23B 則與腫瘤低分化和總生存期(OS)較短密切相關[19]。上述的研究表明circRNA 與NSCLC 的腫瘤大小、淋巴結擴散、遠處器官轉移、低分化程度及生存期直接關聯，這些都是NSCLC不良預后的獨立因素，同時也說明了circRNA在NSCLC中可能是一種潛在的預后標志物。

2.2 circRNA-miRNA-mRNA網絡與NSCLC的治療

在肺癌的治療中，放療和化療是基本的治療手段，另外免疫及靶向治療也占據重要地位。一旦患者出現治療藥物耐藥及放射抵抗，都將導致患者預后變差。此外，患者出現遠處轉移也被認為是治療失敗的原因之一。

順鉑、紫杉醇等化療藥物已經作為NSCLC 指南中的一級推薦用藥，一旦腫瘤對這些藥物產生耐藥將有可能導致治療失敗[20]。Li 等[21]發現NSCLC 組織和細胞中的circ_0072083 表達升高，對其敲低后細胞的生存和轉移都受到抑制，而這一現象隨著順鉑的加入變得更顯著。機制研究發現，circ_0072083 通過海綿miR-545-3p 上調CBLL1(Cbl Proto-Oncogene Like 1)的表達，降低DDP對細胞的毒性作用。Guo等[22]則報道了circ_0011292調節miR-379-5p/TRIM65(Tripartite Motif Containing 65)信號軸促進NSCLC 對紫杉醇產生耐藥。另外，circPVT1 被報道在肺腺癌(LAD)組織中高表達，并與患者的淋巴擴散和化療藥物抵抗(順鉑和培美曲塞)呈正相關，機制上circPVT1 可以通過miR-145-5p/ABCC1(ATP Binding Cassette Subfamily C Member 1)信號軸促進LAD對順鉑和培美曲塞的耐藥[23]。Xiao等[24]研究發現，circRNA_103762在NSCLC組織和細胞中表達上調，并通過抑制CHOP(DNA Damage Inducible Transcript 3)的表達介導NSCLC 細胞的多重耐藥。

此外放射治療是NSCLC 的另一種基礎治療手段。Zhang 等[25]報道了circ_0001287 在NSCLC 組織和細胞系中表達下調，并與NSCLC 的分化程度和淋巴結擴散負相關。機制研究發現，circ_0001287 可以通過海綿miR-21 上調PTEN(Phosphatase And Tensin Homolog)的表達，進而抑制NSCLC 細胞的增殖、轉移和放射抗性。Li 等[26]發現，circMTDH.4/miR-630/AEG-1(Astrocyte Elevated Gene-1 Protein)信號軸可以增強NSCLC 細胞對放射的抵抗性。circ_0086720 也被報道可以通過調控miR-375/SPIN1(Spindlin 1)信號軸增強NSCLC細胞的放射抗性[27]。Jin等[28]對獲得性抗輻射的A549和固有抗輻射的H1299細胞進行高通量測序，通過數據篩選和生物信息學方法構建了一個包含14 個交互配對和8 個circRNA、4 個miRNA和4 個mRNA 的circRNA-miRNA-mRNA 網絡，提供了一種潛在的篩選放療敏感性生物標志物的策略。

腫瘤還可以通過免疫逃避而使人類的免疫系統無法有效識別清除腫瘤細胞。PD-1(programmed cell death 1)是一種免疫抑制分子，可被誘導調節T 細胞，在平衡保護性免疫和免疫病理、內穩態和耐受力方面起著重要作用。然而，在對慢性病原體和腫瘤的反應中，PD1 表達可以限制保護性免疫力[29]。現有研究表明抗PD-1 可以重新激活CD8+T 細胞的抗腫瘤作用[30]。Xu 等[31]研 究 發 現，circMET/miR-145-5p/CXCL3(C-X-C Motif Chemokine Ligand 3)信號軸參與了NSCLC 的免疫逃避。在NSCLC 組織中circMET 或CXCL3 表達和CD8+T 細胞之間呈負相關。研究發現circCPA4 和PD-L1(programmed cell death-Ligand 1)在NSCLC 細胞和癌組織中高表達，并且circ-CPA4 可以通過let-7 miRNA/PD-L1信號軸介導腫瘤免疫微環境中CD8+T 細胞的滅活[32]。circNDUFB2 也被發現在NSCLC 中通過激活RIG-I-mavs 信號級聯，招募免疫細胞進入腫瘤微環境(TME)以激活抗腫瘤免疫系統。而circFGFR1 可以通過海綿上調miR-381-3p 靶基因CXCR4(C-X-C Motif Chemokine Receptor 4)的表達，從而導致NSCLC 對PD-1 治療的耐藥[33]。在NSCLC的靶向治療中，Zhou 等[34]發現circ_0004015 可顯著增加HCC827 細胞對吉非替尼的耐藥性。Ma 等[35]也發現circ_0002130 可以通過靶向miR-498 調節GLUT1(Solute Carrier Family 2 Member 1)、HK2(Hexokinase 2)和LDHA (Lactate Dehy-drogenase A)，最終導致奧希替尼耐藥的發生。

在腫瘤出現轉移時，由鈣離子依賴的細胞粘附素家族(Cadherin)介導的細胞間粘附喪失以及基質金屬蛋白酶(MMP)家族介導的細胞外基質(ECM)降解都在腫瘤侵襲轉移過程中發揮關鍵作用。Wei 等[36]發現circPTPRA 在NSCLC 腫瘤組織中表達顯著下降，并且其低表達水平與遠處轉移及不良預后相關。circPTPRA 可以通過調控miR-96-5p/RASSF8 (Ras Association Domain Family Member 8)/E-cadherin 信號軸抑制NSCLC細胞侵襲轉移的發生。另一項研究發現circCAMK2A 在肺腺癌組織中高表達，并與淋巴結轉移、遠處轉移、晚期臨床階段和預后不佳密切相關；同時觀察到circCAMK2A 可以通過海綿調控miR-615-5p/fibronectin 1 信號軸，從而促進MMP2 和MMP9的表達，以及肺腺癌的轉移[37]。

3 小結與展望

近年來隨著技術的發展，circRNA 被重新認識并重視起來。令人驚喜的是，circRNA 的閉環結構可以使它穩定存在于腫瘤組織和外周循環中，或可提供一種損傷更小、更快捷、準確的早期診斷策略，同時也可作為預后及指導治療的生物標志物。肺癌除了傳統的手術、化療、放療等治療手段外，還有新興的靶向和免疫治療，這讓肺癌患者擁有了更多的治療選擇[38-39]。然而當NSCLC患者出現治療抵抗或者遠處轉移等不良因素時，這些治療方法所取得的效果不顯著，并最終導致治療失敗和疾病進展。因此，不斷探索NSCLC 的發生、發展機制以及探索新的治療靶點仍然是重要的。circRNA-miRNA-mRNA 調控網絡參與了NSCLC 的治療抵抗及轉移的發生、發展。這是一個龐大、復雜的網絡，值得我們對其進行深入探究，闡明其對NSCLC 的致病機制，為患者帶來更多的治療希望。