從活血通絡法探討川芎嗪抗肝纖維化的作用機制研究進展

潘富珍 劉 定

黑龍江中醫藥大學研究生院，黑龍江哈爾濱 150040

肝纖維化是由于各種致病因子長期刺激，如酒精中毒、代謝異常、病毒、自身免疫反應、膽汁淤積等。在肝損傷過程中，肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活，產生過量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），其生成大于降解。如果持續肝損傷就會發展成纖維化，甚至肝硬化和肝癌。肝纖維化的中心環節是HSCs 活化[1]。

近年來發現中藥中提取的一些單體具有延緩肝纖維化進展，甚至逆轉，有獨特的優勢[1]。川芎是活血類藥物，入肝經，有活血化瘀、行氣之功效。川芎嗪是川芎根莖提取的有效成分，為吡嗪類生物堿。可顯著改善患者肝功能，同時降低肝纖維化中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，透明質酸和層粘連蛋白，降低肝組織中丙二醛含量，還具有抑制成纖維細胞分裂、增殖的作用，從而達到防治肝纖維化的目的[2]。本文對近年川芎嗪治療肝纖維化機制研究進展綜述如下：

1 活血通絡理論在肝纖維化治療中的臨床應用

肝纖維化基本病機屬于正虛血瘀，正虛為肝、脾、腎虧虛，血瘀證貫穿肝纖維化始終，且肝纖維化與血瘀程度密切相關，應用活血化瘀通絡之法，以改善機體肝內氣滯血瘀的狀態[3]。若各種病因導致肝失疏泄，日久可引起肝血瘀滯，而瘀血內阻，蘊結于肝，必然損其肝體，阻其肝用，加重肝血瘀滯，形成肝纖維化過程中的病理基礎。《醫學發明·五邪相干》中記載：“血者，皆肝之所主，惡血必歸于肝。”揭示了瘀血與肝的重要關系。川芎入肝經，屬于血中之氣藥，能上行頭目，下調經水，中開郁結，旁通脈絡，活血行氣，發揮活血通絡功效。川芎嗪具有活血化瘀、抗血小板凝聚、直接清除具有細胞毒性作用的自由基、擴張小動脈、保護內皮細胞、改善微循環、抗脂質過氧化及拮抗臟器纖維化等作用[2]。

2 川芎嗪抗肝纖維化作用機制

2.1 參與誘導活化HSCs 凋亡

HSCs 已成為維持正常肝臟穩態和生長的主要調節因子，也是導致肝纖維化的中心環節。誘導活化的HSCs 發生凋亡有助于肝纖維化逆轉。川芎嗪能夠抑制HSCs 增殖，通過抑制ERK 通路并活化p53 蛋白表達，增強p21 和p27 蛋白效應。降低Fas/FasL 細胞因子的表達，阻斷肝細胞凋亡，引起HSCs 發生線粒體凋亡。HSCs 細胞周期停滯于G0/G1期，還可以降低線粒體膜電位，上調Bax，下調Bcl-2 表達，促進釋放Cytc，最終由凋亡蛋白酶caspases 執行促進HSCs 細胞凋亡[4]。

2.2 參與抑制細胞因子

ECM 由基底膜樣基質向間質基質轉變，這些基質蛋白共同激活原本處于靜息狀態的HSCs，導致ECM過度分泌，進一步激活HSCs，形成正反饋環。HSCs 活化相關細胞因子如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、結締組織生長因子（con nective tissue growth factor，CTGF）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。下調這些因子能夠有效抑制HSCs 活化，阻止過度合成ECM，發生抗肝纖維化作用。

2.2.1 TGF-β1 TGF-β 細胞因子有30 多種，肝纖維化與TGF-β1 最相關。Smad 蛋白家族是其下游介質。肝臟長期受損時，TGF-β1 與其受體TGFβ-R 結合，導致Smad2 和Smad3 磷酸化，須與Smad4 結合轉位到細胞核，調控特定基因表達，激活信號通路，ECM 合成過多，引起肝纖維化。而胞漿中Smad6、Smad7 具有負性調控作用，拮抗TGF-β1 所介導的肝纖維化[5]。川芎嗪通過阻斷TGF-β1 細胞因子下游介導通路，抑制Smad2/3 的表達，提高Smad7 的水平，從而阻止肝纖維化的進展[6]。研究發現[7]，試驗組用川芎嗪聯合γ干擾素治療乙肝型肝纖維化，肝纖維化標志物、TGF-β1、Smad2/3/4 下降明顯優于對照組（單獨使用γ 干擾素）。

2.2.2 PDGF PDGF 屬于血清衍生成分的一種，促進HSCs發生高效有絲分裂，有PDGF A、B、C、D 四個基因產物，構成4 個同源二聚體和1 個PDGF-AB 異源二聚體。這些生長因子通過與其功能受體PDGFRα/α、β/β、α/β 結合，激活受體蛋白酪氨酸激酶中兩個基因編碼PDGFRA 和PDGFRB 來調節其作用，是對HSCs 有潛在趨化作用的細胞因子。當肝細胞發生損害時，過度釋放PDGF，作用于HSCs 膜上相應受體，激活特異性信號因子而參與免疫應答[8]。川芎嗪阻止過氧化氫活化的HSCs 增殖。其機制是川芎嗪降低大鼠PDGFβR 表達量，PDGF-βR 下游的ERK 磷酸化和p38 通路作用受到阻斷。可能與川芎嗪降低肝纖維化標志物基因表達，以及調控參與HSCs 活化和ECM 內穩態調節至關重要的蛋白有關[9]。

2.2.3 CTGF CTGF 能夠調控細胞增殖、分化、黏附、血管生成以及組織纖維化。其作為TGF-β 下游介質，誘導細胞周期從G1晚期進入S 期。激活細胞發生有絲分裂，增加成纖維細胞增殖及強烈趨化作用。引起細胞發生增殖并沉積，促進釋放過度ECM 及積聚，同時還能有效防止ECM 降解[10]。研究發現[11]，川芎嗪可能通過下調CTGF，阻斷合成Ⅰ型膠原，發揮抗肝纖維化。川芎嗪抑制HSCs 增殖而改變其周期。此外還可降低HSCs-T6 細胞Bcl-2、CTGF 的表達，增加Bax，從而有效抗纖維化。通過降低CTGF 和Smad2/3 的表達，呈劑量和時間依賴性抑制TGF-β1 誘導的HSCs-T6 細胞的增殖，拮抗肝纖維化[12]。

2.2.4 VEGF VEGF 屬于多功能蛋白中一種，與其受體VEGF-R1 和VEGF-R2 相結合。屬于目前最強烈的促血管生成調控因子，刺激血管內皮細胞增殖、遷移和調節血管滲透性，以及內皮細胞生長、遷移[13]。肝纖維化與形成肝內新生血管息息相關，VEGF 是重要的促血管形成的生長因子，推動肝纖維化。川芎嗪對肝臟的保護作用提供了新的視角，通過下調VEGF-A、VEGF-R2、PDGF-BB 和PDGF-βR 等4 種重要促血管生成因子，抑制血管生成[14]。

2.3 參與調控脂肪細胞因子

脂肪細胞因子來源于脂肪組織，在肝臟中傳遞動態功能，參與調控機體穩態，并參與調節肝纖維化或阻止肝纖維化。血漿中最豐富的脂肪因子脂聯素，除了在脂質和糖代謝方面存在作用外，還具有抗炎反應和肝保護作用，通過多種機制阻止肝纖維化發展。脂聯素與其受體結合后產生信號，對各種肝病起保護作用。瘦素由脂肪組織產生，影響肝內胰島素信號通路，增加肝細胞內脂肪酸含量，最終引起肝細胞變性，促進HSCs 分化，促進肝纖維化發生[15]。

2.3.1 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）抑制劑 肝組織內ECM 降解由MMPs 介導，相應金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）則妨礙其活性。纖維化的程度取決于MMPs 與TIMPs 間的平衡。改變MMP-1 與TIMP-1 比值，抑制TIMP-1 表達，阻止HSCs 增殖和遷移，可預防肝纖維化發生[15]。研究發現[16]，川芎嗪減少膠原和透明質酸，通過增加MMP-13 表達，作用于HSCs，有效調節ECM 發生降解，由于上調MMP-13/TIMP-1 比例，發揮逆轉肝纖維化作用。

2.3.2 瘦素 瘦素是促進HSCs 活化的因子，HSCs 被激活后反過來產生更多瘦素，此正反惡性循環，使TGFβ1 也隨之增加，引起肝纖維化。主要是JAK/STAT 通路被激活，導致下游轉錄因子STAT3 活化后，促進形成ECM，進而誘發肝纖維化[17]。鹽酸川芎嗪中有效成分川芎嗪能夠降低血清中TIMP-1 及瘦素水平，阻斷HSCs 活化，發揮抗纖維化的作用[18]。研究顯示[19]，川芎嗪抑制瘦素誘導的JAK1/STAT3 信號通路的激活，導致α-SMA 和Ⅰ型膠原的減少，從而阻礙HSCs 活化，拮抗肝纖維化。

2.4 參與調控炎癥因子

炎癥反應屬于纖維化的始發階段，肝細胞受損時，引發炎癥反應，誘導HSCs 活化。白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）屬于抗炎因子中一種，抗肝纖維化。IL-1 促進HSCs 活化，并導致生成MMP-13、TIMP-1 和MMP-9，發生肝纖維化。IL-17 也可激活HSCs，產生Ⅰ型膠原蛋白，還可以刺激庫普弗（Kupffer cells，KCs）細胞表達，促進釋放IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎癥因子，導致肝纖維化[20]。研究顯示[21]，川芎嗪對于刀豆蛋白A 誘導的肝纖維化小鼠起到抑制作用，其機制是下調IL-6、IL-1β、TNF-α，上調IL-10。川芎嗪減輕肝纖維化，通過降低TNF-α、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和IL-1β 水平，抑制炎癥反應，保護肝臟免受四氯化碳所致纖維化[22]。

2.5 參與調節氧化應激反應

氧化應激是指有氧代謝產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS）與抗氧化系統清除能力之間的平衡失調。ROS/RNS 激活轉錄因子NF-κB 信號，提高IL-6、IL-1β 促炎因子表達；炎癥細胞活化后，反過來又促進ROS/RNS 產生，加劇氧化應激水平。ROS 也可激活核因子相關因子2（nuclear factor related factor 2，Nrf2）、TGFβ、NF-κB 等相關信號分子及其下游信號通路，調控肝纖維化。肝損傷后，HSCs 被細胞因子和KCs 釋放的ROS 激活，導致HSCs 增殖、合成和分泌ECM[23]。研究顯示[24]，川芎嗪顯著增強HSCs 中Nrf2 的表達和核移位，其抗肝纖維化機制是阻斷Nrf2/β-catenin 通路，對HSCs 行為的負調控。川芎嗪聯合丹皮酚在體內外均有明顯抗肝纖維化作用。這可能是由于HSCs 線粒體功能破壞，從而誘導氧化應激、凋亡、炎癥和抑制ECM 形成與沉積[25]。

2.6 調節肝竇內皮細胞

肝竇內皮細胞（hepatic sinusoidal endothelial cells，LSEC）位于肝臟Disse 間隙內，其特異結構是具有篩選屏障的窗孔和基底膜。肝纖維化出現肝竇毛細血管化，失窗孔、連續基底膜以及HSCs 活化。HSCs 活化和肝纖維化中LSEC 發揮關鍵作用，正常分化的LSEC能夠使活化的HSCs 逆轉至靜息狀態，抑制肝纖維化進展。肝損傷時，LSEC 成為促炎癥因子，同時分泌一系列細胞和趨化因子，加速肝臟炎癥反應以及免疫功能發生改變[26]。研究發現[27]，川芎嗪能抑制典型Hedgehog，抑制體外培養HSCs 血管生成，改善小鼠肝纖維化和肝竇血管生成；還改善HIF-1α，抑制Hedgehog信號傳導，阻止肝竇性血管生成。此外，川芎嗪抑制四氯化碳誘導肝纖維化模型中LSEC 毛細血管化[28]。

2.7 自噬與肝纖維化

自噬對于肝纖維化具有雙重作用，一方面肝纖維化發生通過HSCs 活化，是由于氧化應激介導的內質網應激；通過自噬降解脂滴供應HSCs 活化所需的能量以及自我更新。另一方面抗纖維化作用，肝細胞自噬不僅降低肝細胞死亡，而且通過調控巨噬細胞抑制炎癥因子釋放[29]。動物研究顯示[30]，川芎嗪最佳濃度為25 ng/mL 時能夠刺激大鼠HSCs-T6 的自噬溶酶體，加速自噬溶酶體降解，削弱自噬，阻止肝纖維化持續進展。川芎嗪能明顯減輕肝纖維化，調控免疫系統的不平衡，降低ECM 積聚以及肝纖維化中的自噬信號，抑制AKT-mTOR 信號通路[22]。

3 問題與展望

綜上所述，肝纖維化形成具有復雜的病因及發病機制。包含多種細胞因子、炎癥以及氧化應激反應，構成復雜的調控網絡。其病理基礎是瘀血阻絡，基本病機屬于氣滯血瘀，瘀血阻絡。基本治療方法為活血通絡。中藥川芎為血中之氣藥，氣血同治，氣行則血行，為肝纖維化活血化瘀的常用藥物。川芎嗪為川芎中主要有效成分。綜合近年研究，發現川芎嗪能通過調控TGF-β1、PDGF、VEGF 和CTGF 多種細胞因子，抑制HSCs 活化；誘導活化的HSCs 凋亡；調控脂肪細胞因子、肝臟炎癥反應；抗氧化應激、調節肝竇內皮細胞、自噬等發揮抗肝纖維化作用，減緩肝纖維化進一步發展，甚至能夠有效逆轉已經發生的肝纖維化。但是，目前針對川芎嗪抗肝纖維化研究多局限于單一信號通路或肝纖維化相關因子影響方面，對細胞自噬、外泌體、免疫調節方面研究較少。基于自噬與免疫調節在肝纖維化中的重要作用，將進一步研究中醫藥在免疫調節方面作用，為闡明中醫藥抗肝纖維化作用機制提供更多實驗依據。