心肌細胞株的特性及其在心血管疾病研究中的應用*

田香勤 郭志坤

（新鄉醫學院河南省醫用組織再生重點實驗室，新鄉 453003）

成年大鼠心肌細胞體外培養環境要求較高，難以分離培養[1]。乳鼠的心肌細胞與成年大鼠相比在形態、結構和功能方面具有較大差異[2]，而且乳鼠出生后7 d心肌細胞便停止分裂和增殖[3]，難以進行體外傳代培養，限制了其遺傳操作。心肌細胞的原代分離和純化技術較為復雜，細胞的提取需要以犧牲大量實驗動物為代價。以上原因限制了原代心肌細胞在心血管疾病研究中的應用。近年來，多能干細胞誘導的心肌細胞（cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells，PSC-CMCs）逐漸成為心血管疾病研究的新模型[4]，但由于PSC-CMCs代價昂貴、耗時費力，并且存在誘導效率低和分化成熟度不均一等問題，在科研應用中亦受到一定限制[5]。

心肌細胞株由于其來源穩定，可重復性強，體外培養條件簡單，并且能穩定傳代，在心血管疾病研究中得到越來越廣泛的應用。目前常用的心肌細胞株包括大鼠心肌H9C2細胞株、小鼠HL-1心房肌細胞系、成人心室肌AC16細胞株等，盡管以上心肌細胞株功能相近，但每一種細胞株都有其本身的特性及研究應用中的優缺點。現針對當前心肌細胞株的生物學特性及其應用進行綜述，以拓展其在心血管疾病研究應用中的認識，從而為心血管疾病研究選擇更好的細胞模型提供參考。

1 小鼠H9C2心肌細胞系

1.1 H9C2細胞的基本特性

H9C2細胞是20世紀70年代首個通過細胞連續傳代建立的大鼠心衍生細胞。1976年，Kimes和Brandt從BD1X大鼠13 d胚胎心室組織的細胞克隆中獲得了H9C2細胞株。盡管H9C2細胞未分化為成年心肌細胞，但已經基本具備心肌細胞的生理特性。H9C2細胞和原代大鼠心肌細胞表面被膜中存在類似的糖殘基。在電刺激或用乙酰膽堿刺激作用下，H9C2細胞產生收縮并同時產生動作電位[6]，表現出向外整流的瞬時K+電流以及內向L型Ca2+通道電流的特性[7]。然而，H9C2在形態上具有骨骼肌的特性，細胞中無法觀察到心特異性的形態學結構[8]。

1.2 H9C2細胞的適用性及其優缺點

由于H9C2細胞具有增殖分裂能力強、易于傳代等特點，已經成為研究心肌細胞自噬、缺血缺氧，氧化應激、炎癥、藥物篩選以及藥物毒性代謝的首選細胞[9]。利用原代分離大鼠心肌細胞與H9C2細胞同時作為研究體外心肌肥厚的模型，2種細胞表現出幾乎相同的肥厚反應[10]。研究表明，H9C2細胞和原代分離心肌細胞在相同干預條件下的細胞關鍵基因功能改變基本一致[11]。

在心跨物種研究中，H9C2細胞亦是體外實驗研究的首選。H9C2細胞在細胞毒性、氧化應激和興奮-收縮耦聯Ca2+瞬變等方面與斑馬魚的心肌細胞具有相似的特點[12-14]。另外，大鼠和斑馬魚的miR-1基因序列中，除了“種子序列”外，只有一個核苷酸的差異[15]。因此，在進行斑馬魚心研究時常選用H9c2細胞作為模型。然而，H9C2細胞增殖相關基因與班馬魚心再生基因仍存在差異，除miR-133基因家族外，其他并不相同，對于單個miRNA的功能仍需開展深入研究[16]。

由于H9C2細胞在不同條件下具有向骨骼肌和心肌細胞分化的能力，不同分化狀態的細胞對毒物的敏感性不同[17]。Lenco等利用蛋白組學分別檢測H9C2細胞、原代分離的乳鼠心肌細胞和成年大鼠心室肌細胞時顯示，在H9C2細胞中最典型的12種橫紋肌特征蛋白中沒有一個具有心肌橫紋肌表型，未分化的H9C2細胞與新生心肌細胞和成年心肌的表型存在顯著差異[18]。Branco等利用低血清濃度培養基和全反式維甲酸誘導H9C2細胞分化為心肌細胞樣細胞（H9C2 cardiac-like phenotype cell，H9C2 CM），并研究了H9C2 CM細胞的基因表達譜，發現參與鈣調控、糖酵解和線粒體代謝相關的基因表達增加，與心肌收縮、擴張型心肌病等相關的基因表達明顯上調，從而證實了心肌細胞樣表型的存在[19]。利用同樣的誘導方法，Kankeu等[20]采用蛋白質組學技術分析發現，H9C2細胞分化的早期改變與心肌形態形成和鞘脂合成的蛋白途徑有關。另外，心細胞的分化狀態影響其對毒物的易感性，線粒體凋亡通路在未成熟心肌細胞中比在成年心肌細胞中更活躍[21]。分化程度越高的H9C2細胞對阿霉素線粒體氧化應激和凋亡信號的敏感性越低[22]。由此可見，在利用H9C2細胞作為心細胞模型時，先將其誘導細胞分化為H9C2 CM細胞更具研究意義[17]。

目前，很多研究通過對H9C2細胞誘導和改造，使其更接近心肌細胞的表型。傳統的方法是利用全反式維甲酸誘導或改變細胞外基質微環境[23]。Singla等研究表明，向H9C2細胞內轉導Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc轉錄因子可使其成為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS），該細胞在培養系統中具有向心肌細胞分化的潛能，并能在體內修復梗死后的心肌，改善心功能[24]。另有報道H9C2細胞誘導的iPS細胞在小鼠糖尿病心肌梗死模型心肌中可分化為內皮細胞和血管平滑肌細胞[25]，表明其具有多向分化的潛能。

2 小鼠HL-1心房肌細胞系

2.1 HL-1細胞的來源和基本特性

小鼠HL-1心房肌細胞系是1998年Claycomb教授從Jackson實驗室成年雌性近交系C57BL/6J小鼠身上切除的AT-1皮下腫瘤中獲得的，該細胞可以連續傳代，表現心細胞形態、生化及電生理特性，具有自發的收縮能力和小鼠胚胎心房肌細胞的超微結構特征；HL-1細胞的α-心肌球蛋白重鏈、α-心肌動蛋白、連接蛋白CX43和心房利鈉因子等與成年心房肌細胞具有相似的基因表達模式[26]。Pelloux等[27]報道HL-1細胞具有二氫吡啶受體L型鈣通道，但沒有發現規則肌節的存在。另外，HL-1細胞具有心房心肌細胞典型的乙酰膽堿激活的K+內向整流電流[28]，并具有HCN家族基因參與編碼的超極化激活電流，這是心臟起搏產生和參與調節的基礎[29]。

為了維持HL-1細胞收縮功能和心細胞表型，需要纖維連接蛋白-明膠基質和特殊配方的生長培養基等培養條件[30]。隨著心肌組織工程生物材料的發展，生物支架的應用改變了心肌細胞排列形式，增強了跳動能力和生物活性[31]。細胞的匯集度是HL-1細胞分化的重要因素，高密度培養條件下可增強其收縮活性[32]。

2.2 HL-1細胞的亞克隆

2006年，Pelloux研究組在HL-1細胞株的基礎上分離出不具有跳動功能的細胞株（non-beating HL-1，NB HL-1）。該細胞株與原HL-1細胞相比，除不具有If起搏器電流和自動去極化外，幾乎具備原細胞株的所有特征[27]。在能量代謝方面，NB HL-1細胞與成體大鼠心肌細胞相比，具有較低的氧化磷酸化能力，但糖酵解系統能力較強，糖酵解系統是能量消耗反應中ATP的主要來源[33]，缺乏搏動的NB HL-1細胞在形態學研究及線粒體呼吸代謝研究方面具有較好的優勢[27]。

為獲得更加穩定一致性的細胞系，Diasn等[34]從原HL-1細胞系低密度培養中分離出1、2、3、4、6亞克隆株，其中第6亞克隆細胞（HL1-6）在細胞密度低的情況下具有穩定的收縮表型，其細胞肌節更為典型，動作電位和成年心房肌細胞相似。Houston等[35]證實HL1-6作為心肌細胞房顫模型更為穩定。

2.3 HL-1細胞主要應用優勢

HL-1細胞是體外研究心率失常較好的細胞模型[36]。采用連續均勻高頻率的電場刺激能夠成功制作細胞房顫模型[37]。轉錄組學研究體外HL-1細胞房顫模型顯示，HL-1細胞與人類房顫轉錄組主要基因的改變基本一致[38]，形態上出現相似的肌溶解現象[39]。HL-1細胞具備能分裂傳代和體外容易培養等優勢，有利于基因的導入和敲低，是研究心律失常相關基因優先選擇的細胞[40]。同時，HL-1細胞也是心房細胞體外研究首選的細胞系[41]，在探索心功能調節信號通路等方面發揮重要作用[42]。

3 成人心室心肌AC16細胞株

3.1 AC16細胞基本特征

2005年，Davidson等[43]建立了成人心室心肌AC16細胞株，為研究人類心發生機制和心肌疾病的問題提供了便利。該團隊利用原代成人心室組織的細胞與轉入SV40T抗原基因合并尿苷缺陷性人類成纖維細胞融合，經過亞克隆和細胞篩選獲得AC16細胞克隆。AC16細胞具有心肌細胞的細胞核和線粒體，表達轉錄因子GATA4、MYCD 和NFATc4，具有β-myosin重鏈、心肌動蛋白、肌鈣蛋白I、輔肌動蛋白、中間絲蛋白、肌間線蛋白、縫隙連接蛋白和橋粒斑等心肌特征性蛋白[43]。該細胞最重要的特征是能控制細胞的增殖和分化狀態，當使用RNAi技術沉默致癌基因SV40時，細胞從增殖狀態轉變為分化狀態，表達心特異性標記物BMP2，而增殖細胞不表達BMP2。AC16為研究心肌發育的轉錄調控提供了良好模型，但由于該細胞不具有瞬時K+電流、L型Ca2+電流和If等典型電流，不能產生動作電位，不具有細胞收縮功能[43]。因此，AC16不適合心肌細胞的電生理研究。

3.1 AC16細胞的研究適用優勢

由于AC16保留了原代人心肌細胞的細胞核和線粒體DNA，具有完整的功能呼吸鏈，是探索心肌線粒體功能調節、氧化應激、能量代謝和藥物或環境對線粒體毒性等研究的優先選擇[44]，在研究甲基汞對AC16和H9C2心肌細胞線粒體影響時顯示，AC16細胞在線粒體ATP生成能力方面有更好的藥物毒性劑量依賴性[45]，而線粒體介導的細胞凋亡途徑影響細胞的活性和最終命運。因此，AC16細胞在研究心肌細胞活性和凋亡方面具有重要應用價值[46]。另外，AC16細胞具有成人心室肌細胞所有的DNA序列，決定了它在基因水平上研究的優勢[47-48]，采用二代測序和生物信息學方法分析低氧組和正常組AC16細胞顯示，AC16細胞的mRNAs和miRNAs的改變與心功能密切相關[49]。

4 新型心肌細胞株

成熟的心肌細胞株是研究心血管疾病的重要材料，許多研究人員曾嘗試將SV40大T抗原永生基因轉入心肌細胞建立細胞系。2013年，朱高慧團隊利用腺病毒載體把兩側帶有loxP位點的SV40大T抗原基因轉入15.5 d胎鼠心室肌組織細胞，使細胞得到永生化，構建了iCP15心肌細胞株，iCP15細胞表現出較強的增殖活性，并且其增殖可以通過Cre重組酶去除SV40大T抗原而發生逆轉，從而向心肌細胞分化[50]。2018年，Liu等[5]采用慢病毒載體把由強力霉素條件控制表達的SV40大T抗原基因轉入新鮮分離的新生大鼠心房肌細胞（immortalized atrial myocyte，iAM），獲得無限增殖能力的心房肌iAM-1細胞。該細胞在強力霉素條件下培養進入增殖狀態，喪失了大多數心肌細胞特征，其增殖速度較快，比目前廣泛使用的HL-1細胞高10倍，在缺乏強力霉素的條件下，細胞停止分裂增殖，向心房肌細胞表型分化，在肌節、收縮能力、電特性等方面和原代分離心肌細胞相似[5]。新型細胞株最明顯的特點是能夠利用基因調控技術控制細胞的增殖和分化，從而更有利于控制細胞狀態的一致性。

5 問題與展望

人類的心臟疾病復雜多樣，致病機制的調節難以復制，而心肌細胞株有其良好的遺傳穩定性和單一的生存條件，更有利于重復模擬單因素試驗研究。因此，需要構建更好的心肌細胞株來滿足當前科研需要。但目前通過體外構建的心肌細胞株與來自體內的心肌細胞表型及功能仍存在差異，科學家應該尋找新的誘導藥物，同時充分利用現代生物技術（如基因編輯技術），通過改良細胞培養環境，研發新的細胞培養載體，構建與人類心肌細胞形態和功能更為接近的心肌細胞株，為心血管疾病研究及臨床應用提供更大便利。