DNA甲基化在免疫型復發性流產中的研究進展①

賈紫千 馮曉玲 李娜 張楊 蔣莎（黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040）

復 發 性 流 產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指孕婦在妊娠20周前，連續發生2次或2次以上的自然流產，發病率約為2%~4%［1］。導致RSA發病的原因復雜，其中約一半的RSA夫婦不能被明確診斷，稱為不明原因復發性流產（unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA）。正常妊娠的建立需要母體對胚胎半同種異體抗原產生免疫耐受，以防止母體免疫系統對胚胎產生免疫攻擊，而引發流產［2］。這種免疫因素造成的RSA與母體自身抗體及母體免疫耐受失衡有關，其中后者與URSA關系密切。母胎界面上的免疫細胞對維持母胎免疫耐受平衡起關鍵作用［3］。DNA甲基化為廣泛存在的表觀修飾方式，異常的DNA甲基化可影響免疫細胞的增殖、分化及凋亡，而介導多種免疫性疾病的發生與發展［4］。因此，DNA甲基化可通過調控母體自身抗體及免疫細胞功能介導RSA的發生。

1 DNA甲基化

DNA甲基化屬于一種動態的表觀遺傳修飾，是甲基化與去甲基化平衡的過程，其在決定哺乳動物細胞發育、譜系識別和轉錄調控方面發揮重要作用［5］。DNA甲基化是通過DNA甲基轉移酶（DN‐MT1、DNMT3A、DNMT3B）的催化，將活化的甲基添加到第5個碳位置CpG二核苷酸的胞嘧啶上，最終形成5-甲基胞嘧啶產物（5-methylcytosine，5-mC）的過程［6］，其可引起DNA構象改變，從而影響機體免疫相關基因及細胞因子的轉錄與表達。DNA甲基化的異常可表現為甲基化缺陷、高甲基化及甲基化酶高表達。DNA低甲基化促進基因轉錄，使免疫細胞異常活躍，免疫功能紊亂。哺乳動物的DNA甲基化動態過程大體都表現出生殖細胞高甲基化、胚胎低甲基化［7］。著床發育過程DNA甲基化的缺陷可導致胚胎發育障礙及胚胎死亡，高甲基化可引起胚胎細胞基因突變［8］。在胚胎發育過程中，DNA甲基化轉移酶是促進細胞分化的必需酶，DNMT1的主要作用是通過DNA的復制來維持甲基化水平，研究認為DNMT1的紊亂可引起絨毛組織中DNA甲基化水平降低，是導致早期妊娠失敗的原因［9］。而DN‐MT3A和DNMT3B稱為從頭甲基化，是將未發生甲基化的CpG催化出新的甲基化位點，可促進蛻膜細胞、滋養細胞的分化與增殖及胚胎的發育［10］。

2 DNA甲基化在免疫型RSA中的作用

免疫因素導致的RSA可分為母體自身抗體對胚胎產生排斥反應的自身免疫型RSA，以及母胎界面中母體免疫耐受功能失衡，無法識別來自父系的胚胎抗原呈現低免疫反應，引起母體封閉抗體陰性而攻擊胚胎的同種免疫型RSA。

2.1 在自身免疫型RSA中的作用自身免疫型RSA可因母體患有某種自身免疫性疾病，而產生特定的抗體，排斥胚胎著床及發育，包括組織非特異性自身抗體及組織特異性自身抗體。

2.1.1 組織非特異性自身抗體組織非特異性自身抗體包括抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody，aPL）、抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）及抗DNA抗體等。aPL又包括抗心磷脂抗體（anticardio‐lipin antibody，ACA）、狼瘡抗凝因子、抗β2糖蛋白1（β2GP-1）抗體。ACA陽性是導致RSA發病最主要的原因，ACA可通過胎盤血管內皮競爭性結合磷脂受體，損傷胎盤血管內皮，使胎盤形成血栓，導致蛻膜與胎盤供血不足、胎盤栓塞梗死，造成妊娠失敗［11］。約20%的RSA患者合并有抗磷脂抗體綜合征（antiphospholipid antibody syndrome，APS）［2］。有研究發現，抗β2GP1-CXCL4抗體復合物可激活內皮細胞釋放促炎和促凝血因子形成APS模型，激活DNMT3B、TET1、HDAC9等甲基轉移酶表達，可影響APS患者白介素8（interleukin-8，IL-8）啟動子和組織因子（tissue factor，F3）第一內含子的表觀遺傳修飾的改變，其中IL-8啟動子甲基化可作為APS的鑒別因素或臨床表現，IL-8和F3甲基化水平的差異預示了血栓形成前的炎癥過程［12］。ANA和抗DNA抗體多在系統性紅斑狼瘡及類風濕性關節炎等自身免疫性疾病中呈陽性，其引發RSA的機制尚不明確，抗DNA抗體與RSA的關系尚存爭議。目前認為ANA導致的RSA可能是由于感染因素，導致子宮內膜炎癥的發生，使胚胎不能植入；或血液中的ANA免疫復合物沉著于蛻膜血管組織中，影響胎盤發育，造成早期妊娠丟失［13］。有研究發現患有自身免疫性疾病的患者T細胞中含有低甲基化的DNA和類似的自身免疫性T細胞亞群，認為DNA甲基化的缺陷是自身免疫性疾病的發病原因［14］。

2.1.2 組織特異性自身抗體組織特異性自身抗體包括抗精子抗體（antisperm antibody，AsAb）、抗卵巢抗體（anti ovarian antibody，AoAb）、抗子宮內膜抗體（endomethal antibody，EmAb）、抗甲狀腺抗體（antithyroid antibody，ATA）等。AsAb可通過干擾精子獲能及頂體反應阻礙受精卵的形成，同時激活巨噬細胞形成，殺傷精子或受精卵，從而造成早期流產。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）可與人類AsAb發生反應，阻止受精，HSPA1L啟動子的DNA甲基化降低，可使該蛋白含量上調，則含有HS‐PA1L的精子更容易被殺傷［15］。AoAb的產生代表自身免疫功能的紊亂，卵巢受到感染產生抗體，而影響卵巢功能，抑制卵子排出，使卵巢內分泌功能紊亂，著床后卵巢分泌的雌孕激素不足，進而導致RSA的發生。DNMT存在于卵母細胞中，隨著卵母細胞的生長到胚胎的植入，呈現動態的增加，DNMT的缺陷會導致卵母細胞成熟受損、胚胎死亡及異常基因表達相關的綜合征，如免疫功能異常［16］。Em‐Ab的形成可由于子宮內發生炎癥反應，從而激活子宮內膜組織抗原形成抗體，受損的子宮內膜可影響胚胎的植入或發育，引起流產。研究發現反復胚胎植入失敗的婦女子宮內膜的網蛋白表達下調，在整個月經周期中，子宮內膜中的甲基化譜是發生變化的，在子宮內膜甲基化的基因組調控下，可影響子宮內膜生物學的改變［17］。妊娠早期正常的生理變化，如血漿血量增加、碘濃度降低、甲狀腺結合球蛋白產生增加，都可導致妊娠期間對甲狀腺激素的需求增加，當RSA患者免疫功能紊亂，血清ATA含量升高，高表達的ATA引起胎盤反應性增高，致使胎盤功能降低，發生流產［18］。經研究證實甲狀腺功能亢進患者的T淋巴細胞和B淋巴細胞整體呈低甲基化趨勢，DNMT1的表達也普遍偏低［19］。

2.2 在同種免疫型RSA中的作用母胎界面屬于獨特的免疫位點，可耐受半同種異體的胎兒，并維持宿主對病原體的防御。同種免疫型RSA的發生是母體免疫細胞與來自滋養層及蛻膜中的胎兒免疫細胞之間的免疫耐受不平衡導致的，包括固有免疫紊亂和獲得性免疫紊亂。胚胎的植入過程表現為一種促炎狀態，妊娠的維持需要母胎間各類細胞因子處于平衡［2］。

2.2.1 固有免疫固有免疫屬于自然的免疫反應，固有免疫應答的細胞可永久性的存在于母胎界面，尋找可威脅妊娠的外來抗原。胎盤及蛻膜是固有免疫應答的重要組成部分，蛻膜可合成各種趨化因子，包括自然殺傷（natural killer，NK）細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）及補體系統等。

2.2.1.1 NK細胞蛻膜NK細胞可促進血管生成和滋養層的入侵，與胎盤的發育密切相關。正常妊娠者外周血NK細胞含量在受精卵植入后呈下降趨勢，RSA患者外周血中NK細胞CD56+/CD16+升高，可損傷妊娠組織，導致RSA［20］。有研究發現DNA甲基化的變化與人類NK細胞活化程度相關，活化的NK細胞可導致CpG低甲基化，已知的DNA甲基化調節的免疫位點也在活化的NK細胞（如TNF-α、LTA、IL-13、CSF2）中發現。活化的NK細胞處于高度去甲基化狀態，而原始NK細胞處于低去甲基化狀態，說明NK細胞的甲基化具有可塑性和重塑性［21］。提示隨著受精卵的植入到胚胎的形成，NK細胞表達升高導致的DNA去甲基化過程異常，可能是RSA的發病原因。

2.2.1.2 巨噬細胞巨噬細胞屬髓樣免疫細胞，主要分為兩種類型：M1型具有殺菌和促炎功能，M2型具有免疫調節功能。受精卵著床前，蛻膜巨噬細胞向M1型極化，被認為是人類胚胎和子宮內膜間活躍的介質，可調節炎癥反應，使腫瘤因子表達升高［22］。在胚胎植入后，蛻膜基質中的M2型巨噬細胞顯著增加，使T淋巴細胞活躍，吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）高表達，保護胎盤及胎兒的發育，當胎盤發育結束，蛻膜巨噬細胞表達開始下降［23］。研究認為母胎界面上強烈的促炎反應可能不利于妊娠的維持，而DNA甲基化有助于母胎界面上的巨噬細胞發揮抗炎作用，且母體細胞與胎兒細胞的DNA甲基化存在顯著差異，與免疫應答相關的甲基化多在胎兒細胞中呈高表達［24］。SPINELLI等［25］通過實驗發現，人類IDO1基因甲基化異常的改變與流產的發生有關，妊娠期間抑制IDO1的活性可導致胎兒死亡，對早期流產的整倍體胎盤分析顯示呈高甲基化表達。

2.2.1.3 DCs DCs被稱為有效的抗原提呈細胞，在免疫應答過程中具有誘導抗原特異性激活和抑制的獨特能力，DCs可激活NK細胞，調節T淋巴細胞分化及Th細胞平衡，存在于非妊娠子宮、子宮內膜、胎盤和蛻膜中［22，26］。DCs在蛻膜基質細胞中含量較低，但具有識別胎兒抗原的能力，在調節活化的母體T細胞中起重要作用。著床時子宮內的DCs可能是對胎兒最大的免疫威脅，隨著胚胎的植入，遷移的DCs在蛻膜基質中生長，并通過基質細胞衍生因子及其受體調節蛻膜血管的生成和血管擴張，從而促進胎盤的形成及胚胎的發育［27］。調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）是蛻膜組織免疫耐受所需要的抑制性CD4+T輔助細胞的一個子集，正常妊娠人類的外周血Treg數量呈上升趨勢，蛻膜組織中Foxp3+Treg水平的降低是導致流產發生的原因，而DCs可促進效應T細胞中Foxp3位點呈低甲基化狀態，使母胎界面免疫功能紊亂，發生RSA［28-29］。

2.2.1.4 補體系統補體系統（complement sys‐tem，CS）為多種自身免疫性疾病的發病機制，在缺血/再灌注過程中導致多種炎癥驅動，而造成組織損傷。正常妊娠期間，CS在母胎界面上被激活，若胎盤中補體激活過多可能存在胎盤損傷及胎兒死亡的風險，因此在胎盤中保持CS的平衡非常重要。人體中補體C3含量最高，來源于胎盤，為胚胎營養因子，是CS的樞紐，可介導補體系統激活，對妊娠早期胎盤的發育起重要作用［30］，但若其含量過高，引起補體系統過度激活，是導致免疫型RSA發生的原因。有研究發現C3基因體中有明顯的高甲基化CpG區，從而激活CS，使過多的補體在胎盤中沉積，誘導免疫性損傷，形成血栓前狀態，抑制胚胎發育，與RSA關系密切［31］。

2.2.2 獲得性免疫獲得性免疫是后天機體免疫系統受到病原體及有毒代謝產物等抗原刺激后，產生特異性抗體的識別及防御能力，促進免疫應答。Treg的異常表達、輔助性T細胞（T help cell，Th）的失衡及封閉抗體（blocking antibodies，BA）的缺失都是引起獲得性免疫功能紊亂，導致RSA的發病機制。

2.2.2.1 Treg Treg可分為來源于胸腺的天然Treg（nTreg）及在外周由幼稚細胞誘導的適應性Treg（iTreg），nTreg有助于抑制免疫排斥，而iTreg的免疫調節能力相對較弱，nTreg的標志物CD4+CD25+Treg的低表達能夠破壞免疫耐受［32］。妊娠期Treg主要集中于母胎界面，蛻膜T細胞可調節胎盤微環境并識別胎兒抗原，防止免疫排斥，促進胚胎植入［33］。Treg的缺陷是導致反復胚胎植入失敗或胚胎停育，形成RSA的原因。Treg的缺陷是由機體轉錄因子Foxp3突變或缺失引起的，nTreg的發育不僅需要Foxp3的表達，還需要建立nTreg型CpG的低甲基化模式［34］。胚胎植入的過程相當于炎癥反應，有研究證實腫瘤壞死因子受體2（tumor necrosis factor receptor2，TNFR2）在炎癥條件下表達，TNFR2可通過限制Foxp3啟動子的DNA甲基化來誘導Treg，并激活DC調節其功能［35］。因此Foxp3的正常表達及nTreg DNA低甲基化，對于妊娠的維持至關重要。

2.2.2.2 輔助性T細胞Th根據功能不同可分為Th1、Th2及Th17［36］。Th1主要參與外周組織器官特異性自身免疫性疾病的發生，促進免疫排斥反應，是造成RSA的潛在原因。Th2參與抗炎反應，可減少胚胎毒性的分化，調節免疫應答，抑制Th1的分化功能［37］。因此，正常妊娠的建立，母胎界面細胞因子需要偏于Th2的表達。Th17可產生一系列促炎細胞因子和宿主防御因子，在預防妊娠期病理感染中發揮重要作用［2］。Th17異常表達，與胎兒丟失有關，可能導致RSA［38］。有研究發現正常妊娠前期Th2通路基因甲基化水平的變化更為頻繁，而在妊娠后期Th1通路CpG甲基化水平的變化較頻繁，因此Th1與Th2基因甲基化變化的情況與妊娠的維持相關［39］。YANG等［40］對CD4+T細胞分泌的Th1和Th17 DNA甲基化水平的變化進行了全面分析，相比于Th1，Th17 DNA去甲基化區域的數量更多，與nTreg有更大的重疊。

2.2.2.3 封閉抗體BA是因胚胎同種半異體移植物刺激人類白細胞（human leukocyte antigen，HLA）、滋養細胞及淋巴細胞等抗原與母體免疫系統反應所產生的一類保護性IgG抗體，其可阻斷母體免疫系統對胚胎的攻擊。BA的缺乏或水平較低，可影響母體免疫應答，是導致URSA發生的主要原因。HLA-G基因主要在妊娠期母體胎盤細胞中表達，該基因編碼多種亞型，可在整個母胎界面上完成多種功能，HLA-G蛋白水平的降低是妊娠失敗的原因，-725G等位基因的甲基化可抑制HLA-G轉錄，下調HLA-G蛋白表達，致使胚胎丟失［41］。

3 結語

成功的妊娠離不開各種免疫因素間的動態平衡，母體自身免疫抗體的產生及母胎界面間的免疫調節失衡，都是影響胚胎植入，導致RSA發生的原因。DNA甲基化的異常不但與多種免疫性相關疾病的發生有關，又可通過影響母胎界面的免疫耐受，引起母體免疫系統對胚胎產生防御性排斥反應。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾領域中最具前景及敏感性的生物學標志物，其在腫瘤學中研究廣泛，認為DNA甲基化的發生早于基因突變，并可直接從組織中獲取相關遺傳物質，對疾病進行預防及治療。免疫型RSA與腫瘤的發病機制類似，都表現為各類免疫細胞異常的表達而對免疫應答產生抑制作用。相信隨著對表觀遺傳學研究的深入，可以進一步探索出DNA甲基化對免疫型RSA的靶向診斷及精準治療，以促進生殖醫學更快的發展。