細胞焦亡在肝纖維化發生、發展中的作用研究進展*

萬義鵬，張望，朱萱

（南昌大學第一附屬醫院 消化內科，江西 南昌330006）

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的最后共同通路，其由各種病因導致肝星狀細胞活化，膠原纖維產生過多、分解減少，最后引起膠原纖維過度沉積于細胞外間質而形成，如病因未得到控制，則可進一步發展為肝硬化、肝癌，最終肝功能衰竭導致死亡[1-2]。細胞死亡是非常普遍的生命現象，在生長發育和疾病的發生、發展中都扮演著重要作用[3]。在肝臟疾病中可觀察到肝細胞、巨噬細胞、肝星狀細胞死亡，以及不同細胞死亡形式，包括壞死、自噬、凋亡、鐵死亡、焦亡[4-5]。細胞焦亡是近年來發現的一種新型促炎程序性細胞死亡。本文主要綜述肝臟內各種細胞焦亡在肝纖維化發生、發展中的作用。

1 細胞焦亡的途徑

在1992年，細胞焦亡的形態特征和功能在革蘭陰性桿菌感染的巨噬細胞中被觀察到，但當時被誤認為是細胞凋亡[6]。直到2000年，BRENNAN等[7]才首次提出細胞焦亡的概念。細胞焦亡是一種新型促炎程序性細胞死亡的方式，其依賴于半胱天冬酶（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase）活化，隨后介導Gasdermin D（GSDMD）水解成有生物活性的GSDMD-N，嵌入細胞質膜并形成直徑10～15 nm 膜穿孔，導致細胞通透性增加、離子代償失調、細胞間質的水流入細胞內導致細胞腫脹、乳酸脫氫酶和促炎細胞因子的大量釋放，如IL-1β、IL-18[8-9]。

細胞焦亡是由Caspase 活化介導的程序性細胞死亡的結果，其由經典焦亡途徑和非經典焦亡途徑。經典途徑是指依賴于Caspase-1 活化介導的細胞焦亡，而Caspase-1 的活化依賴于不同的炎癥小體活化后將pro-Caspase-1 剪切為成熟的Caspase-1。目前研究證實與細胞焦亡相關的炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2 炎癥小體[10]，而研究最為廣泛的是NLRP3 炎癥小體活化介導的經典細胞焦亡。NLRP3 由包括C 端富含亮氨酸的重復序列、中心核苷酸結合寡聚化域、N 端半胱天冬酶激活和募集域或Pyrin 域組成[11]。中心核苷酸結合寡聚化域結構域具有激活后NLRP3 寡聚化所需的ATP酶活性，NLRP3 的Pyrin 結構域與ASC 的Pyrin 結構域相互作用以啟動炎性體組裝，配體識別和自身免疫需要富含亮氨酸的重復序列[11]。在受到病原相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs）刺激后招募凋亡相關斑點蛋白，并與NLRP3 形成偶聯體，將pro-Caspase-1 剪切為成熟Caspase-1，活化的Caspase-1， 進一步將GSDMD 剪切為GSDMD-N 和GSDMD-C，最后由GSDMD-N 形成細胞膜穿孔，同時釋放大量的促炎因子，形成炎癥聯級反應，加重炎癥、促進疾病的進展[8，12]。除了GSDMD， GSDMs 還包括 GSDMA、 GSDMB、GSDMC、GSDME 和PJVK 等[13-14]。這 些GSDMs 有2 個保守域，包括C 端域和N 端，這2 個結構域結合在一起可以穩定GSDMs 構象。然而，GSDM 在剪切C 端結構域后，其N 端蛋白水解酶被釋放，并與細胞膜的脂質成分結合形成寡聚體導致細胞膜穿孔誘導細胞焦亡[3]。然而，有研究還發現除了GSMDM，Gasdermin 家族蛋白其他成員并不是Caspase 的底物，不參與細胞焦亡[15]。

非經典途徑是依賴于Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導的細胞焦亡[3]，值得注意的是非經典途徑細胞焦亡有種屬之間的差異，即Caspase-4、Caspase-5 介導人源細胞焦亡，Caspase-11 介導鼠源細胞焦亡[16]。與Caspase-1 不同的是，Caspase-4、Caspase-5、Caspase-1 的N 端半胱天冬酶激活和募集域結構域可以與細菌的脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）和革蘭陰性桿菌產生的外膜囊泡直接結合并剪切Pro-Caspase-4、 Pro-Caspase-5、 Pro-Caspase-11，活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 水解GSDMD 成為GSDMD-N，形成細胞膜穿孔，誘導焦亡的發生[17-18]。有研究表明，活化Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 可以直接誘導細胞焦亡，同時也可以間接通過GSDMD 介導的細胞膜孔形成K+外流，或Pannexin-1 裂解/ATP釋放/P2X7/K+釋放介導的非經典NLRP3 炎癥小體信號通路誘導細胞焦亡[19-20]。另外有研究表明Caspase-11 可能通過GSDMD 誘導的膜孔的K+流出，顯著激活NLPR3 依賴性Caspase-1 炎癥小體，進一步激化經典途徑細胞焦亡[21]。因此，不難發現GSDMD 在經典細胞焦亡途徑與非經典細胞焦亡途徑中均發揮執行蛋白的功能，具有重要作用。另外，細胞焦亡的非經典途徑與經典途徑存在交互作用。

2 細胞焦亡對肝纖維化的影響

眾所周知，肝星狀細胞活化是肝纖維化發生、發展的中心事件，其活化后產生結締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitors of metalloproteinases 1, TIMP1）和膠原蛋白沉積，促進疾病的發生、發展。研究表明肝星狀細胞可發生細胞焦亡，并被活化后高表達纖維化相關基因[22]。其機制可能是細胞焦亡后釋放的IL-1β 通過IL-1R1、JNK 和AP-1信號通路促進靜止型肝星狀細胞向活化型肝星狀細胞改變，促進肝纖維化發展[23-24]。

細胞焦亡的發生依賴于炎癥小體、Caspase 和GSDMD 的介導。WREE 等[24]研究表明NLRP3 誘導細胞焦亡會增加CTGF、TIMP1 的表達和膠原蛋白的沉積。另外，在突變的NLRP3 敲入過表達的小鼠模型中，NLRP3 介導細胞焦亡導致更加嚴重的肝臟炎癥和纖維化[24]。相反，NLRP3 缺乏可以緩解硫代乙酰胺、四氯化碳和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（Methionine-choline deficiency, MCD）誘導的肝纖維化[25-26]。有研究表明，Caspase-1 抑制劑可阻斷肝細胞焦亡并抑制肝星狀細胞活化，最終緩解肝纖維化[27]。嗜酸性粒細胞也可發生細胞焦亡，并介導肝星狀細胞活化，促進肝纖維化的發生、發展；而Caspase-1 抑制劑可緩解嗜酸性粒細胞焦亡和肝纖維化[28]。GSDMD 在細胞焦亡、肝臟炎癥及肝纖維化中起重要的作用，尤其在細胞焦亡過程中起著不可或缺的作用[8，29]。在MCD 飲食的肝纖維化模型小鼠中，GSDMD敲除的小鼠平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、轉化生長因子β的基因表達及羥脯氨酸含量顯著低于野生型小鼠，表明GSDMD 在MCD 誘導的肝纖維發展中起到重要作用[29]。

3 各種肝臟內細胞焦亡與肝纖維化的關系

肝臟是對各種病原微生物及其產物產生防御的第一道防線。肝臟巨噬細胞、肝細胞、肝星狀細胞的炎癥小體高表達，并且在受到PAMPs 和DAMPs 刺激后可激活，發生炎癥反應、抵抗相關損害因素，同時也可介導細胞焦亡[30]。

3.1 肝細胞焦亡與肝纖維化

許多研究已觀察到在肝纖維化中肝細胞可發生細胞焦亡。WREE 等[24]復制全身和髓樣細胞特異性NLRP3敲入過表達的2 種小鼠模型，以闡明在不同細胞中激活NLRP3 炎癥小體對肝臟病理生理的差異。該研究發現與全身敲入NLRP3小鼠相比，髓樣特異性NLRP3小鼠檢測不到肝細胞焦亡，并且肝臟炎癥、肝星狀細胞活化和纖維化的嚴重程度也較低。該研究首次發現肝細胞焦亡在肝纖維化中的重要作用[24]。該研究團隊最近復制了肝細胞特性敲入NLRP3過表達的小鼠模型，發現小鼠可自發性發生肝臟炎癥及肝纖維化改變[27]。這個結果直接證實了NLRP3 介導經典途徑的肝細胞焦亡在肝纖維化發生、發展中起到非常重要作用。同時在體外實驗中發現，原代小鼠肝細胞及人肝細胞在LPS 加尼日利亞菌素（NIG）處理后可發生細胞焦亡，并將NLRP3 炎癥小體的寡聚體釋到細胞外，可在上清液中檢測到。通過對NLRP3 寡聚體進行熒光標記后與肝星狀細胞共培養，結果表明肝星狀細胞可以內吞炎癥小體的寡聚體并激活靜息狀態的肝星狀細胞，使I 型膠原蛋白和α-SMA 表達明顯升高。這些結果表明肝細胞焦亡和炎癥體成分的釋放是傳播肝損傷和肝纖維化發展的又一新分子機制[27]。有研究發現micro-RNA 也可參與調控肝細胞焦亡、肝纖維化。LI 等[31]研究觀察到亞砷酸鹽可誘導肝細胞Cleaved-Caspase-1、GSDMD 表達升高，IL-1β 釋放增加，而miR-379-5p 水平下降；miR-379-5p 過表達可抑制砷酸鹽誘導的GSDMD 水平升高和IL-1β 釋放，從而改善肝細胞焦亡、肝損傷。研究還發現亞砷酸鹽誘導肝細胞焦亡后的上清液處理刺激肝星狀細胞，結果肝星狀細胞被活化，分泌I 型膠原蛋白、α-SMA 水平升高，而使用IL-1β 中和抗體后可抑制肝星狀細胞活化[31]。另外研究發現熒光素酶報告基因檢測表明GSDMD 是miR-379-5p 的直接靶標。同時miR-379-5p 在亞砷酸鹽誘導肝損傷和肝纖維化的分子機制在動物內體實驗得到驗證。這些研究結果表明miR-379-5p可以直接調控GSDMD，改善肝細胞焦亡，間接調控肝星狀細胞狀態，從而調節肝損傷及肝纖維的進展。另一個研究發現了一個新型的肝細胞焦亡信號通路在肝纖維化中的作用[32]。該研究指出鞘磷脂合酶1（Sphingomyelin synthase 1, SMS1）產生的甘油二酯（Diacylglycerol, DAG）激活PKCδ、NLRC4炎癥小體以誘導肝細焦亡焦，而抑制Caspase-1、NLRC4 和SMS1 缺乏可減輕高脂高膽固醇飲食誘導的肝細胞焦亡、肝臟炎癥和肝纖維化。該模型中敲除NLRC4可以阻止肝細胞焦亡和肝臟炎癥的發展。研究表明，SMS1 是通過DAG/PKCδ/NLRC4 炎癥小體信號通路介導經典途徑的肝細胞焦亡，促進NASH 和肝纖維化發生、發展[32]。

3.2 肝星狀細胞焦亡與肝纖維化

NLRP3 炎癥小體在肝星狀細胞內中等表達，并可以介導焦亡發生[22，33-34]。KONG 等[22]研究發現，日本血吸蟲的可溶性蛋抗原可誘導肝星狀細胞中Caspase-1 和反應活性氧族（reactive oxygen species,ROS）明顯升高，同時乳酸脫氫酶和碘化丙錠染色也明顯升高。而使用ROS 抑制劑可下調肝星狀細胞Caspase-1 活性和細胞焦亡。該研究表明可溶性蛋抗原可通過ROS 介導Caspase-1 活化導致肝星狀細胞焦亡，促進肝臟炎癥進展及肝纖維化的形成[22]。另一項研究報道在酸誘導的模型中酸感應離子通道1a（Acid-sensing ion channel 1a, ASIC1a）介導肝星狀細胞活化，α-SMA 和I 型膠原蛋白表達水平顯著升高，但NLRP3、凋亡相關斑點蛋白和GSDMD 表達下調。相反，抑制或沉默ASIC1a 可以促進肝星狀細胞焦亡和肝纖維化進展[35]。DONG等[36]研究表明，棕櫚酸可以激活肝星狀細胞上的TLR4/NF-κB/NLRP3 炎癥小體信號通路激活肝星狀細胞，促進肝纖維進展。JIANG 等[37]研究發現ATP刺激人肝星狀細胞后，P2x7R、NLRP3、Caspase-1和IL-1β 明顯升高，并且α-SMA 和I 型膠原蛋白也升高；使用P2x7R 選擇性抑制劑后上述現象被抑制。研究表明，ATP 可通過P2x7R/NLRP3 炎癥小體信號通路介導肝星狀細胞活化。

3.3 肝臟巨噬細胞焦亡與肝纖維化

肝臟巨噬細胞是肝臟內表達NLRP3 的主要來源，其在介導巨噬細胞活化和焦亡中起到重要作用[34]。肝臟巨噬細胞是肝臟抵抗病原微生物和發揮自身免疫功能的第一道防線，在肝臟的炎癥反應中發揮重要作用[38]。研究表明肝臟巨噬細胞在NASH 和肝纖維化等疾病中起到重要作用[39-41]。然而，肝臟巨噬細胞焦亡在肝纖維化發生、發展中作用的研究非常有限。在2020年，ZHANG 等[42]研究了lncRNA-Lfar1 在肝纖維化中對肝臟巨噬細胞焦亡的作用。該研究發現，在四氯化碳和膽管結扎誘導的肝纖維化模型中沉默lncRNA-Lfar1 可減輕NLRP3 介導的肝臟巨噬細胞焦亡。體外實驗同樣表明lncRNA-Lfar1基因沉默可顯著抑制LPS/ATP 和LPS/NIG 誘導的NLRP3 炎癥體介導KCs 焦亡。表明肝臟巨噬細胞焦亡可以促進肝纖維化。這些結果表明，lncRNA-Lfar1 調控肝臟巨噬細胞焦亡在肝纖維化發生、發展中起至關重要的作用，并可能成為治療肝纖維化的新靶標[42]。考慮到肝臟巨噬細胞焦亡在肝纖維化發生、發展中的相關研究很少，且相關分子機制尚未完全闡明，因此將來需要進一步研究來證實其重要性。

4 總結

細胞焦亡是依賴于Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導的促炎性程序性細胞死亡，釋放大量促炎因子，促進肝臟炎癥和肝臟疾病發展。目前研究最為廣發的是NLRP3 炎癥小體活化介導的經典途徑細胞焦亡。肝臟內的肝細胞、肝星狀細胞和肝臟巨噬細胞均可發生細胞焦亡，釋放大量的促炎癥細胞因子，促進肝臟炎癥和肝星狀細胞活化，進而促進肝纖維化的發生、發展。因此，不可否認的是細胞焦亡可能成為治療肝纖維化的新靶點。目前研究已報道Caspase-1 和GSDMD 的抑制劑可以緩解細胞焦亡。但是，不可忽視的是抑制細胞焦亡的同時可能會下調自身免疫力，從而增加感染的風險和不良反應。因此，在未來需要進一步研究如何精準、適度地調控細胞焦亡，以達到緩解肝臟炎癥和纖維化，又不過度下調自身免疫力而增加感染風險的目的。