病原微生物莢膜多糖的生物學(xué)功能

謝黎卿，楊 洋，彭遠義，李能章

(西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400700)

莢膜多糖最早于1917年由Avery和Dochez[1]在研究肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)時發(fā)現(xiàn)，后被證明這種物質(zhì)是存在于微生物莢膜中的碳水化合物。莢膜多糖作為病原微生物最外層的保護成分，可有效保護菌體免受或少受多種殺菌、抑菌物質(zhì)的損傷，有助于病原體在宿主內(nèi)定植和為入侵宿主爭取時間。當缺乏營養(yǎng)時，莢膜多糖還可轉(zhuǎn)換為碳源或氮源，為細菌提供能源，有助于細菌在饑餓環(huán)境中生存[2]。目前，雖然對莢膜多糖結(jié)構(gòu)多樣性、生物合成及其免疫原性等方面進行了研究，但對莢膜多糖在病原菌黏附過程中的作用，特別是莢膜多糖的合成調(diào)控方面研究仍然欠缺；其次，研究主要集中在莢膜多糖對病原菌本身的作用，有助于病原菌的免疫逃避和致病作用機制方面，而對莢膜多糖與宿主免疫細胞因子的拮抗及促進宿主免疫調(diào)控方面的研究稍顯不足。作者結(jié)合本團隊的相關(guān)研究工作，對國內(nèi)外莢膜多糖合成調(diào)控、生物學(xué)功能、免疫逃避機制和致病機制，以及莢膜多糖對宿主免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)研究進展進行綜合闡述，為莢膜多糖的后續(xù)研究和利用莢膜多糖預(yù)防或治療疾病提供借鑒。

1 莢膜多糖結(jié)構(gòu)

莢膜多糖通過分子間氫鍵及其他非共價鍵緊密地連接到細胞表面，并在細胞周圍形成莢膜[3]，通常是宿主遇到的第一個菌體結(jié)構(gòu)[4]。大部分莢膜多糖以2種或以上的單糖作為重復(fù)單元，連接成長且復(fù)雜的多糖鏈，再形成空間結(jié)構(gòu)不同的多聚體。某些微生物莢膜多糖中還存在多肽及脂質(zhì)，如炭疽桿菌(Bacillusanthracis)[5]、巨大芽胞桿菌(Bacillusmagaterium)[2]。單糖的種類、主鏈的排列方式和空間結(jié)構(gòu)等也會改變莢膜多糖性質(zhì)。如肺炎鏈球菌血清型19F和19A具有非常相似的三糖重復(fù)單位，但二者構(gòu)象存在明顯的差異，19F型主要是延伸的構(gòu)象，而19A型表現(xiàn)出很高的緊致發(fā)夾彎曲，這可能是19F型和19A型之間缺乏抗體交叉保護的原因[6]。此外，多糖鏈中還存在支鏈、有機或無機分子，這些因素使莢膜多糖結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，并且碳水化合物的修飾對莢膜多糖的免疫原性也有重要影響[7]。

2 莢膜多糖合成與調(diào)控

2.1 多糖合成相關(guān)基因

莢膜多糖合成相關(guān)基因主要包含莢膜多糖合成調(diào)節(jié)基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和轉(zhuǎn)運基因，多糖的生物合成可分為ABC轉(zhuǎn)運體-依賴途徑、合酶-依賴途徑和Wzy-依賴途徑，不同微生物莢膜多糖合成相關(guān)基因各有特點。

大多數(shù)革蘭陰性菌的莢膜多糖合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因都位于染色體上，且能夠協(xié)同調(diào)節(jié)。本團隊主要研究多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)莢膜多糖合成相關(guān)基因，以此為例闡述。多殺性巴氏桿菌的莢膜可分為A、B、D、E、F 5型，它們的莢膜合成基因簇包含3個區(qū)域[8-10]。其中，區(qū)域1和區(qū)域3(腦膜炎奈瑟菌中為C區(qū)和B區(qū))分別編碼莢膜轉(zhuǎn)運所需的ABC轉(zhuǎn)運蛋白(A、D、F型為hesABCD，B、E型為cexABCD)和莢膜錨定結(jié)合所需的蛋白(A、D、F型為phyAB，B、E型為lipAB)，這些基因在5種血清型中具有同源性[9]。區(qū)域2 (腦膜炎奈瑟菌中的區(qū)域A)編碼莢膜多糖合成相關(guān)基因，并且該區(qū)域具有血清型特異性[9]。A、D、F型的區(qū)域2位于區(qū)域1和3之間，包含4個基因，A型為hyaBCDE，D型為dcbBCFE，F(xiàn)型為fcbBCDE，其主要區(qū)別是hyaD、dcbF、fcbD分別編碼了PmHAS(透明質(zhì)酸合成酶)[11]、PmHS(肝素合成酶)[12]、PmPC(軟骨素合成酶)[10]；而B、E型的區(qū)域2位于區(qū)域3的lipAB基因之間，B型為bcbABCDEFGHI，E型為ecbABJKDEFGI，兩者相對應(yīng)基因所編碼的產(chǎn)物也具有同源性[9, 13]。

革蘭陽性菌中肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的莢膜多糖合成相關(guān)基因研究最多。根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)和抗原性的差異，肺炎鏈球菌現(xiàn)已被證明可產(chǎn)生90多種莢膜類型，除血清3和37型的莢膜多糖合成由單個膜結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)外[14]，其余都由Wzy聚合酶所依賴的機制產(chǎn)生，并且Wzy血清型的莢膜多糖合成位點都位于染色體上dexB和aliA基因之間的同一區(qū)域[15]。莢膜多糖位點啟動子序列(cpsp)和前4個基因cpsA至cpsD高度保守，參與莢膜多糖調(diào)控，cpsD下游基因具有血清型特異性，主要負責(zé)多糖的聚合和輸出[16-17]。莢膜血清5和8型是金黃色葡萄球菌的主要類型，cap5和cap8莢膜多糖基因簇結(jié)構(gòu)高度相似，它們的等位操縱子都由16個基因組成，從cap5/8A到cap5/8p，其基因產(chǎn)物參與莢膜的生物合成、O-乙酰化、運輸和調(diào)節(jié)[18-19]。這16個基因中有12個在cap5和cap8操縱子之間是相同的，這可能是cap5和cap8莢膜多糖具有相似的三糖重復(fù)單元，只是O-乙酰化的位置和連接單糖位置不同的原因[20]。cap8位點的分子特征表明，16個基因都是從第1個基因上游的初級啟動子轉(zhuǎn)錄成一個大的轉(zhuǎn)錄單元，且位于初級cap8啟動子235序列上游的1個10 bp反向重復(fù)序列已被證明是完整表達8型莢膜基因簇所必需的，這表明DNA結(jié)合調(diào)節(jié)因子也參與了莢膜合成調(diào)控[20]。

2.2 莢膜多糖合成調(diào)控

快速適應(yīng)外部環(huán)境變化對微生物的生存和增殖至關(guān)重要，莢膜多糖作為病原微生物莢膜的主要成分，是細菌定植和感染過程中不可或缺的部分。大部分受莢膜多糖保護的細菌細胞可不被吞噬細胞吞噬，而未被莢膜包裹的細胞才能黏附到宿主內(nèi)皮細胞，因此細菌對莢膜多糖合成調(diào)控非常重要。在這個過程中，細菌對營養(yǎng)傳感通路、轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)和宿主環(huán)境有關(guān)的各種信號作出反應(yīng)，為微生物提供更好的適應(yīng)性。以下根據(jù)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制述之。

2.2.1 群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控 群體感應(yīng)(QS)是微生物群體在其生長過程中，通過產(chǎn)生和擴散小的化學(xué)或信號分子來進行交流的機制，調(diào)控菌體基因表達，并且不同微生物種群間群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控機制也不盡相同。轉(zhuǎn)錄因子Rgg群體感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于低G+C革蘭陽性菌中，以Rgg作為信息素疏水短肽(shp)的受體[21]，如獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)中Rgg發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，誘導(dǎo)shp的表達，使shp發(fā)揮自身誘導(dǎo)劑作用，形成正反饋回路，調(diào)節(jié)獸疫鏈球菌莢膜多糖的產(chǎn)生和生物膜的形成，而Rgg/shp系統(tǒng)的失活降低了莢膜多糖的產(chǎn)生和生物被膜的形成[22]。創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)生物被膜形成晚期階段，細菌細胞密度足夠高時，AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的主調(diào)控因子SmcR通過與莢膜多糖基因簇的上游區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)莢膜多糖的表達，從而限制生物被膜的大小[23]。此外，AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)也參與金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌莢膜多糖的合成調(diào)控[24-25]。本團隊根據(jù)qseC蛋白和luxS蛋白分別屬于AI-3和AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)[26-28]，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了多殺性巴氏桿菌PmCQ2-ΔqseC敲除株及PmCQ2-ΔqseCΔluxS雙敲除株，對比PmCQ2野生株與敲除株的莢膜多糖合成量、生物膜形成量及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，敲除株的莢膜多糖合成量降低、生物膜形成量增加、莢膜多糖合成相關(guān)基因hyaD與hyaE的表達量下調(diào)。這表明多殺性巴氏桿菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)與莢膜多糖的合成調(diào)控也存在一定聯(lián)系，但具體的信號傳導(dǎo)機制還需進一步研究。

2.2.2 雙組分系統(tǒng)調(diào)控 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCSs)是微生物中感受和響應(yīng)外界環(huán)境信號的機制之一，由跨膜的組氨酸激酶蛋白(HK)作為感應(yīng)蛋白和細胞質(zhì)內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(RR)組成，在不同刺激下激活TCS導(dǎo)致HK發(fā)生自動磷酸化，隨后將磷酸基轉(zhuǎn)移到RR，磷酸化的RR通過改變基因表達使細菌產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)[29]。研究顯示，當肺炎鏈球菌在入侵期間暴露于宿主血清時，VncR/S(調(diào)控因子VncR和激酶VncS)雙組分系統(tǒng)中VncS能夠感知血清中VncS配體血清乳鐵蛋白(LF)并導(dǎo)致VncS磷酸化，磷酸化的VncS可為VncR提供磷酸基，而磷酸化的VncR又與其莢膜多糖位點啟動子序列特異性結(jié)合，從而改變莢膜多糖基因的表達，使肺炎鏈球菌適應(yīng)血液環(huán)境并有利于對宿主的侵襲[30]。YycF/G(調(diào)控因子YycF和激酶YycG)[31]、ComD/E(調(diào)控因子ComE和激酶ComD)[15]雙組分系統(tǒng)也參與肺炎鏈球菌莢膜多糖的合成調(diào)控。ArlR/S(調(diào)控因子ArlS和激酶ArlR)[32]雙組分系統(tǒng)通過正調(diào)控mgrA(mgrA是金黃色葡萄球菌5型和8型莢膜基因簇表達的主要激活因子)，間接促進金黃色葡萄球菌莢膜多糖的合成[20]。RcsB/C(調(diào)控因子RcsB與激酶 RcsC)是腸桿菌中非常典型的一種調(diào)控莢膜多糖基因簇表達的雙組分系統(tǒng)[33]，而RcsA/B(調(diào)控因子RcsA和調(diào)控因子Rcs)雙組分調(diào)控蛋白是一種非典型的雙組分系統(tǒng)。Rcs A/B通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控莢膜多糖合成位點基因簇中的靶基因，潛在調(diào)控肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)rmpA、wcaI、gmd等莢膜多糖合成基因的表達[34]。此外，莢膜多糖合成基因簇上的酪氨酸激酶CpsD可自身磷酸化(CpsD參與莢膜多糖水平磷酸化的調(diào)節(jié))，CpsD通過與腺苷酸激酶(SpAdK)生物物理相互作用，促進肺炎鏈球菌血清2型D39菌株莢膜多糖的合成[16]，而大腸桿菌血清型K30的CpsD突變體會削弱自身莢膜多糖的合成水平[35-36]。

2.2.3 第二信使調(diào)控 第二信使能夠很敏感地感受外界環(huán)境的變化，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，能間接調(diào)控莢膜多糖相關(guān)基因的表達。其中，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)二鳥苷酸(cGMP)與莢膜多糖合成調(diào)控研究的比較多。研究顯示，新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)在可獲得性鐵離子減少時，鐵調(diào)節(jié)因子Cir1通過調(diào)控編碼cAMP/PKA(蛋白激酶A, PKA)信號通路各組成部分，調(diào)控其莢膜多糖的合成，但具體機制還不清楚[37]。ScrABC操縱子中ScrC蛋白(一種潛在的感覺蛋白)通過控制cGMP的形成和降解，反向調(diào)節(jié)莢膜多糖基因表達[38]。cGMP還可負調(diào)控肺炎克雷伯菌莢膜多糖的合成，降低細菌毒力[39]。實際上，cGMP在不同細菌中的主要共同作用是通過控制細菌在浮游生活方式和生物被膜生活方式之間的轉(zhuǎn)變來調(diào)節(jié)細菌的生活方式[40]，而莢膜多糖與生物被膜密切相關(guān)，這說明第二信使可潛在調(diào)控莢膜多糖的合成，但如何調(diào)節(jié)卻知之甚少。

廣泛的研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)、pH、二氧化碳和氧氣可用性、滲透壓、溫度等環(huán)境因素都可影響莢膜多糖的合成調(diào)控[41-43]。綜合分析來看，莢膜多糖的合成通常受多系統(tǒng)多因素調(diào)控，并非僅受一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，且多發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。同時，不同機制組合也會產(chǎn)生不同的結(jié)果，如ComE雖然負調(diào)控肺炎鏈球菌莢膜多糖的合成，但在胞外葡萄糖濃度變化時，會轉(zhuǎn)而正向調(diào)節(jié)莢膜多糖的合成[15]。

3 莢膜多糖生物學(xué)功能及免疫逃避機制

3.1 耐干燥

莢膜具有高度水合性，而莢膜多糖通過形成保持水分的物理屏障來增強細菌脫水耐受性[44]。研究顯示，鮑曼不動桿菌AB5075菌株可形成VIR-O不透明菌落，Tipton等[45]構(gòu)建了該不透明菌落中菌株的莢膜多糖缺失株Δwzc，將這兩種菌株置于干燥環(huán)境下12 d后，比較莢膜多糖缺失株與野生株耐干燥的能力，發(fā)現(xiàn)莢膜多糖缺失株的活力比野生型下降了約2.5倍(原文如此)，當恢復(fù)Δwzc菌株合成莢膜多糖的能力時，這種喪失的活力得以恢復(fù)。干燥環(huán)境下，滲透壓的改變也可能是細菌對莢膜多糖合成調(diào)控的原因，但具體機制還不清楚。

3.2 抗凍性

微生物能夠在世界上所有環(huán)境中定居，包括一些極端環(huán)境(例如，強鹽湖、冰面、火山)，莢膜多糖有利于微生物在這些環(huán)境中生存。Vessella等[46]從0 ℃ 以下的北冰洋沉積物中分離出冷紅科爾韋爾菌34H(Colwelliapsychrerythraea34H)，這種細菌能夠產(chǎn)生一種獨特的莢膜多糖，多糖通過釘扎和固定冰粒邊界來抑制冰的重結(jié)晶，從而保護細菌在低溫環(huán)境下生存，其抗凍特性類似于著名的抗凍蛋白(glyco)，可用于合成低溫保護劑。

3.3 黏附與抗黏附

某些細菌莢膜多糖有選擇的與特定細胞表面結(jié)合，使莢膜多糖具有黏附功能。如A族鏈球菌(Group AStreptococcus)莢膜多糖(主要成分為透明質(zhì)酸)通過與透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白CD44特異性結(jié)合來介導(dǎo)細菌附著在宿主細胞上[47]。此外，初始黏附時，細菌將發(fā)出信號，啟動特定基因的表達，促進黏附素的合成并伸出莢膜外形成菌毛，莢膜多糖減少并暴露黏附素受體位點，促進病原菌與宿主細胞的黏附，并在目標細胞表面形成小菌落群體[48-49]。研究顯示，長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)莢膜多糖缺失株ΔcpsD能夠明顯促進菌毛的形成[50]，這表明莢膜多糖阻礙了細菌與靶細胞的黏附。

生物被膜黏附于宿主組織細胞表面，是病原菌在宿主內(nèi)持續(xù)定殖和引起感染的主要策略之一，而細菌間的黏附是生物被膜形成的必要條件。生物被膜形成早期，細菌啟動特定基因的表達，促進胞外多糖(EPS)的合成，莢膜多糖表達量下調(diào)；在生物被膜形成晚期或生物被膜引起宿主慢性感染時，細菌將促進莢膜多糖的合成，阻礙細菌間的黏附，使病原菌從生物被膜中脫落，調(diào)整生物被膜大小或促進宿主持續(xù)感染[23, 51]。本課題組前期從病牛肺中分離到1株莢膜多糖含量較少的A型多殺性巴氏桿菌弱毒株P(guān)mCQ6，與莢膜多糖含量較高的強毒株P(guān)mCQ2基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)PmCQ6的1個莢膜多糖合成基因存在點突變。通過同源重組質(zhì)粒構(gòu)建點突變恢復(fù)株P(guān)mCQ6c并比較兩者生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)PmCQ6形成的生物被膜大約是PmCQ6c的3倍。假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)莢膜多糖缺失株也表現(xiàn)出附著生物被膜的形成能力增強的現(xiàn)象[52]。此外，莢膜多糖還被證明在物理上阻斷了大腸桿菌生物膜形成中所必需的黏附因子[49]。因此，莢膜多糖與生物被膜的形成呈負相關(guān)，抗黏附功能是其原因之一。

3.4 抵御補體殺傷

補體系統(tǒng)是免疫的重要組成部分，在宿主抵御病原體感染和產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等方面起關(guān)鍵作用[53]。一方面，莢膜多糖減少調(diào)理素蛋白C3b在病原菌細胞表面沉積。當C3裂解過程發(fā)生在病原菌附近時，暴露的C3b硫酯鍵可與菌體表面蛋白質(zhì)和多糖在短時間內(nèi)發(fā)生穩(wěn)定的共價結(jié)合，將入侵的病原菌標記為周圍補體的焦點[4]。莢膜多糖通過形成外部屏障，阻礙C3b與莢膜下病原菌細胞表面的親核靶標結(jié)合，從而逃避補體系統(tǒng)介導(dǎo)的殺傷作用[54]。同理，莢膜多糖通過掩蔽經(jīng)典途徑中菌體表面抗原的抗體識別位點，阻止抗原抗體復(fù)合物的形成，最終抑制C1相關(guān)補體反應(yīng)[55-56]。另一方面，部分細菌莢膜多糖通過抑制膜攻擊復(fù)合物(MAC)形成，防止病原菌細胞被MAC溶解[57-58]。

3.5 抗吞噬

吞噬細胞能夠攝取和摧毀入侵的病原菌，并在其表面呈遞病原菌抗原，引發(fā)宿主產(chǎn)生先天性免疫反應(yīng)。病原菌的莢膜通常會損害吞噬功能，生理 pH條件下，大部分微生物莢膜帶負電荷，可阻止帶同種電荷的吞噬細胞的吞噬，并且菌體表面莢膜多糖表達量越高，莢膜越厚，抗吞噬作用就越強[59-61]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2和PmCQ6菌株在感染巨噬細胞時，對比二者進入巨噬細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)PmCQ6被吞噬進入細胞的百分比顯著高于PmCQ2，表明莢膜多糖具有抗吞噬作用[62]。唾液酸化的莢膜多糖還可與宿主抑制性Siglecs(唾液酸結(jié)合免疫球蛋白型凝集素)結(jié)合，減少中性粒細胞的活化[63]。此外，某些細菌莢膜多糖具有酸堿電解質(zhì)特性，可提供相當大的緩沖能力，通過干擾吞噬小體的形成而阻礙吞噬細胞的吞噬。如新生隱球菌莢膜多糖通過調(diào)節(jié)吞噬小體內(nèi)的pH并干擾吞噬小體的酸化，從而阻礙吞噬作用[64]。

3.6 抵抗陽離子抗菌肽

抗菌肽(antimicrobial peptide，AMPs)是天然免疫中具有殺菌活性的成分，且?guī)缀跛锌咕亩际顷栃缘模谒拗骱筒≡w共同進化過程中，病原微生物已經(jīng)發(fā)展出感知并啟動對抗菌肽的適應(yīng)性反應(yīng)的能力，以抵抗它們的殺菌活性[65-66]。帶負電荷的莢膜多糖可作為誘餌，結(jié)合帶正電荷的陽離子抗菌肽，減少到達病原菌表面的抗菌肽數(shù)量[67]，防止因抗菌肽破壞病原菌胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)而引起的膜兩側(cè)離子流通紊亂[68]。研究顯示，人抗菌肽(LL-37)亞抑制濃度可上調(diào)A族鏈球菌CPS合成操縱子(HasABC)的表達[69]。進一步研究顯示，腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)對LL-37也具有高度敏感性，其莢膜多糖的喪失使LL-37殺菌效果顯著增強，LL-37的最小抑菌濃度(MIC)也出現(xiàn)了降低[70]。

表1 CPS生物學(xué)功能

4 莢膜多糖與免疫

4.1 莢膜多糖致病機制

大部分病原微生物莢膜多糖可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，但某些莢膜多糖免疫原性極低[72]。如新生隱球菌莢膜多糖可與CD44受體結(jié)合，而CD44基因缺失小鼠增加了對新生隱球菌的抵抗力[73]。這類莢膜多糖與宿主細胞基質(zhì)具有相同或類似的成分，使宿主很可能無法產(chǎn)生針對該靶標的抗體，這也許是病原菌抵御宿主特異性免疫反應(yīng)并促進感染的重要原因。此外，莢膜多糖可誘導(dǎo)細胞凋亡，如綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)莢膜多糖通過上調(diào)FAS/FASL信號蛋白和裂解caspase-8誘導(dǎo)外源性細胞凋亡，并激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑JNK和p38信號通路促進活性氧物種(ROS)依賴的內(nèi)源性細胞凋亡，共同誘導(dǎo)綿羊氣道上皮細胞凋亡[74]。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，采用透明質(zhì)酸酶處理PmCQ2和PmCQ6以減少菌體表面的莢膜多糖再感染巨噬細胞(A型多殺性巴氏桿菌莢膜多糖主要成分為透明質(zhì)酸)，與未用透明質(zhì)酸酶處理的PmCQ2和PmCQ6感染的巨噬細胞相比，處理組上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌均顯著降低，表明A型多殺性巴氏桿菌莢膜多糖對宿主免疫細胞因子的產(chǎn)生也有一定的影響[62]。本課題組最近研究證實，與PmCQ2感染的巨噬細胞相比，PmCQ6能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生更高水平的NLRP3轉(zhuǎn)錄、caspase-1活性和成熟IL-1β的分泌，主要原因可能是PmCQ2菌體表面莢膜比PmCQ6厚得多，同時莢膜還可能影響NLRP3炎癥小體的激活[75]，但具體機制有待進一步研究。

4.2 莢膜多糖抑制炎癥反應(yīng)

莢膜多糖是微生物表面的重要毒力因子，常以參與宿主的致病機制呈現(xiàn)，但部分微生物莢膜多糖也可正向調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，降低宿主炎癥反應(yīng)，保護宿主處于健康狀態(tài)。以腸道微生物中的脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)為例，其莢膜多糖在保護其自身逃避宿主免疫反應(yīng)和適應(yīng)腸道微環(huán)境的同時，還可通過調(diào)節(jié)腸道免疫信號通路產(chǎn)生細胞因子，減輕宿主炎癥并增強腸上皮的功能，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[76-77]。脆弱擬桿菌能表達8種莢膜多糖(A～H)[78]，其中，免疫調(diào)節(jié)能力最強的是莢膜多糖A (PSA)，PSA的四糖重復(fù)單元具有兩性離子多糖結(jié)構(gòu)(包含正電荷和負電荷)，這種特殊的莢膜多糖結(jié)構(gòu)使PSA可直接作為T細胞抗原來調(diào)節(jié)T細胞作用[79]。PSA誘導(dǎo)T細胞的活化必須通過抗原提呈細胞(APC)處理，遞呈一段多糖(類似于提呈抗原肽的方式)到主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(MHC-Ⅱ)分子上[79-80]，多糖與T細胞上的α-β T細胞受體(TCR)相互作用，進而刺激CD4+T細胞產(chǎn)生IL-10[81]，IL-10可以抑制腸道和全身(包括大腦)的致病性炎癥[82](如圖1)。此外，PSA還可與T細胞上的Toll樣受體2(TLR2)結(jié)合直接作用于FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)，在促進IL-10產(chǎn)生的同時抑制輔助性T細胞17(Th17)反應(yīng)和白細胞介素17(IL-17)的產(chǎn)生(IL-17可促進腸道膿腫的形成)，保護宿主免受腸道炎癥的影響，同時促進脆弱擬桿菌在宿主腸道中獨特的黏膜生態(tài)位定植[83]。研究顯示，無菌小鼠的輔助性T細胞2(Th2)扭曲分布，比常規(guī)動物表達更高水平的Th2型細胞因子[如白細胞介素4(IL-4)]，這使宿主更容易被感染并產(chǎn)生過敏和炎癥性疾病[84]，而PSA可作用于輔助性T 細胞1(Th1)，誘導(dǎo)宿主建立適當?shù)腡h1/ Th2平衡來促進腸道或脾內(nèi)的動態(tài)平衡和免疫系統(tǒng)的發(fā)育[80, 84]，從而與宿主建立有益的共生關(guān)系。

5 莢膜多糖的應(yīng)用

5.1 PSA在疾病預(yù)防與治療中的應(yīng)用

多糖被普遍地認為是不依賴于T細胞的抗原，不會誘導(dǎo)輔助性T細胞的激活和刺激B細胞中Ig類的轉(zhuǎn)換或免疫記憶[86]，但PSA現(xiàn)被證明可激活T細胞群，通過抑制致病性炎癥細胞來預(yù)防各種炎癥性疾病[87]。有研究顯示，PSA能夠介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，將無菌小鼠缺少的T細胞擴增到常規(guī)小鼠的水平[83]。實際上，PSA本身也能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的人原代胎兒小腸細胞系(H4細胞)的炎癥，預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)[88]。純化的PSA還可用于預(yù)防H型肝炎引起的小鼠結(jié)腸炎[81]。

除調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)外，PSA也可用于預(yù)防或治療腸道外疾病(例如腦、肺)。PSA通過與腸道駐留的漿母細胞結(jié)合，誘導(dǎo)CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IL-10和γ-干擾素(IFN-γ)，從而減輕腦干炎癥并預(yù)防致死性單純皰疹病毒性腦炎(HSE)[85, 89]。研究顯示，口服純化的PSA對預(yù)防和治療小鼠腦脊髓炎(EAE)也具有保護作用[87]。在誘導(dǎo)氣管炎癥之前，口服PSA或轉(zhuǎn)移PSA免疫小鼠脾T細胞能夠防止白細胞浸潤和肺部病變，可預(yù)防哮喘(asthma)的發(fā)生[90]。此外，PSA誘導(dǎo)FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生的IL-10，還可預(yù)防肺部炎癥[91]。

5.2 CPS疫苗

莢膜多糖作為毒力因子，可用于制備疫苗來預(yù)防相應(yīng)病原引起的感染，但大部分病原的莢膜多糖免疫原性較差，需與蛋白質(zhì)載體結(jié)合才能更好地觸發(fā)保護性和記憶性B細胞反應(yīng)，最常見的載體蛋白包括破傷風(fēng)類毒素和白喉毒素的無毒突變體CRM197[92]。以血清2型豬鏈球菌莢膜多糖與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)制備的莢膜多糖復(fù)合疫苗，能夠促進抗莢膜多糖的IgG抗體產(chǎn)生，在動物試驗中也表現(xiàn)出良好的免疫原性和誘導(dǎo)保護作用，此疫苗與佐劑結(jié)合使用，還能夠在小鼠和豬體內(nèi)誘導(dǎo)有效的IgM和同型轉(zhuǎn)換的IgG[93]。大量研究表明，莢膜多糖載體結(jié)合疫苗比非結(jié)合疫苗具有更好的免疫原性，結(jié)合疫苗能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生更高水平的抗體[92]。如采用全長乙型肝炎病毒核心抗原病毒樣顆粒(HBc VLPs)作為新型載體蛋白，將不同長度(2、5和10 ku)的異雙功能聚乙二醇(PEG)與C群腦膜炎耐瑟菌莢膜多糖偶聯(lián)，制備的CPS-PEG-HBc結(jié)合疫苗誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性IgG滴度比普通莢膜多糖疫苗高10倍左右，且對宿主的親和力、產(chǎn)生功能性抗體和免疫記憶顯著增強[94]。

圖1 PSA免疫調(diào)節(jié)通路及對宿主疾病的預(yù)防和治療[80, 83, 85]Fig.1 PSA immunoregulation pathway and prevention and treatment of host diseases[80, 83, 85]

6 小結(jié)與展望

莢膜多糖既可作為毒力因子逃避宿主免疫監(jiān)視促進致病性感染，也可抑制炎癥反應(yīng)，促進宿主免疫功能，增強宿主對病原菌的抵抗能力，并在其生長繁殖和應(yīng)對不良環(huán)境過程中起著關(guān)鍵作用。本課題組主要研究了牛源A型多殺性巴氏桿菌莢膜多糖對宿主的免疫調(diào)控作用，在多殺性巴氏桿菌莢膜多糖劑量差異調(diào)動宿主免疫反應(yīng)的模式機制及是否存在促其他病原免疫保護性方面取得了部分進展，并且多殺性巴氏桿菌弱毒株本身也可以作為疫苗進行開發(fā)，研究清楚弱毒株莢膜多糖致病機制可以將其應(yīng)用于臨床流行菌株來開發(fā)使用范圍更廣的弱毒株疫苗。目前，雖然莢膜多糖結(jié)合疫苗均發(fā)揮了良好的作用，但其主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(MHC-Ⅱ)表位的確切性質(zhì)目前尚不清楚，并且莢膜多糖致病和免疫調(diào)控機制的關(guān)鍵分子也還有待進一步研究。從莢膜多糖合成調(diào)控、功能到其致病性和免疫調(diào)控能力探討，再到莢膜多糖高效疫苗及莢膜多糖預(yù)防或治療疾病的模擬應(yīng)用，仍是莢膜多糖今后研究的方向。