噬菌體的跨黏膜轉位以及噬菌體對機體免疫影響的研究進展

劉燕坤，林 焱，朱偉云

(國家動物消化道營養國際聯合研究中心，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室， 南京農業大學消化道微生物研究室，南京 210095)

噬菌體是一類可特異性感染細菌、霉形體、螺旋體、放線菌的病毒，廣泛存在于環境和生物體中，根據感染后細菌宿主的不同結果，噬菌體可分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體(也稱為溶原性噬菌體)。其中，烈性噬菌體自其發現之初就因其可直接裂解殺死宿主菌的特性而被當作天然的抗菌劑來控制細菌感染性疾病，這種方法又被稱為噬菌體療法。而后因抗生素的發現以及噬菌體自身的局限性，有關噬菌體療法的研究幾乎停滯。近年來，隨著細菌的耐藥性越來越嚴重，這一古老但仍處于起步階段的方法又重新受到重視。作為一種具有廣泛應用前景的抗菌劑，目前，噬菌體的研究主要集中于針對人及動物的耐藥菌感染性疾病(如致病性大腸桿菌感染[1]、銅綠假單胞菌感染[2]、金黃色葡萄球菌感染[3]、鮑曼不動桿菌感染[4])和環境中特定病原菌的消毒(如醫院環境中致病菌[5]、堅硬物體表面生物被膜[6-8]和食品中食源性病原菌的清除[8-9])，并且均已取得不錯的效果。

人體微生物群落在黏膜器官分布最多，特別是在腸道。腸道是人和動物體中微生物種類和含量最為豐富的部位，對于腸道細菌菌群對機體健康的重要作用成為近二十年研究的熱點，并取得一些重要進展，包括微生物-腸-腦軸和微生物-腸-肝軸的發現[10]。噬菌體的生存繁殖依賴于宿主菌，理論上講，有細菌的地方即有噬菌體存在。隨著測序技術的發展，腸道病毒組在腸道生態中的作用逐漸受到關注，腸道病毒的宏基因組學研究表明，腸道病毒中的絕大部分是噬菌體，且已被證實與腸道細菌菌群緊密相關，其可通過裂解活動和水平基因轉移等來調控腸道內菌群組成和代謝特性，進而影響下游菌群代謝產物的組成及水平。

雖然噬菌體治療機體細菌感染效果十分顯著，但目前對腸道噬菌體的研究多集中于對腸道菌群和腸道健康的影響，噬菌體本身對機體免疫系統影響的研究尚不夠深入，對噬菌體跨腸黏膜轉位進入機體后對機體健康和免疫系統影響的研究同樣較少。因此，本文對目前已有的針對噬菌體對于真核細胞乃至機體整體免疫功能影響的研究進行綜述，為今后更廣泛深入地研究提供參考。

1 噬菌體黏附于黏膜并發揮抗菌作用

機體的黏膜分布于消化道、呼吸道、生殖道等多個器官中。黏膜表面暴露于外環境中，執行物質交換功能的同時也會與大量微生物接觸，但黏膜的屏障作用可保護機體抵抗外環境中的病原入侵。黏膜表面的黏液層是構成黏膜物理屏障的重要組成部分之一，同時，黏液層還可為共生微生物的定殖提供生存環境，形成生物屏障。此前，關于黏膜生物屏障的研究更多集中于黏膜菌群，由于有細菌的地方就會有噬菌體存在，因此，噬菌體在黏膜表面的分布與功能以及對機體健康的作用也逐漸受到關注。

近些年的研究表明，噬菌體可黏附于黏膜并發揮抗菌作用。Barr等[11]發現，噬菌體在黏膜黏液層內平均濃度比鄰近非黏膜環境高出4.4倍，且該種現象依賴于細胞表面黏液的存在，并通過體外噬菌體黏附試驗提出BAM模型(bacteriophage adherence to mucus)，即噬菌體通過其衣殼表面的蛋白多聚體，如T4噬菌體衣殼表面具有4個Ig(immunoglobulin)樣折疊的Hoc蛋白，與黏蛋白表面的高變異性多糖相結合來黏附于黏膜表面，通過烈性噬菌體對細菌宿主的裂解和子代病毒的產生減少黏膜表面病原菌的定殖，形成一種非宿主來源的免疫。黏蛋白是黏膜器官(如腸道)黏液層中主要的結構組分，在黏液層中呈現梯度分布，黏蛋白濃度從上皮細胞側至腔側逐漸降低；黏膜上皮細胞分泌黏液補充黏液層與黏液層從腔側脫落流失處于動態平衡中，使黏液層保持一定的厚度，在此基礎上，黏液層中的微生物群落也處于不斷周轉的狀態。最近的研究表明，在中低黏蛋白濃度下，T4噬菌體可通過Hoc蛋白與黏蛋白短暫結合而減慢移動速度，表現出在黏液層中的亞擴散運動，由此在黏液層中適宜的濃度區域形成亞擴散區，亞擴散運動可以使T4噬菌體更加徹底地搜索局部黏液層網絡中黏附的細菌宿主，從而可在低宿主菌濃度時提高噬菌體與細菌宿主的相遇概率，增強抗菌效果[12]。此外，關于溶原性噬菌體和裂解性噬菌體在腸道黏膜的分布，有學者最近提出一種新的細菌-噬菌體互作動態模型，即Piggyback-the-Winner(PtW)，該模型認為，在高微生物豐度和高生長速率時，溶原狀態占主導地位，并根據腸道黏液層濃度梯度推測，溶原作用主要發生在黏液層的頂部，而裂解性噬菌體的捕食主要發生在細菌稀疏的中間層[13]。

噬菌體黏附于黏膜的現象不僅發生于體內的黏膜組織，對于存在于體外的黏膜同樣適用。Almeida等[14]的研究證實，柱狀黃桿菌噬菌體FCL-2可在虹鱒魚表面黏膜存留1周以上，在柱狀黃桿菌攻毒前3 d使用FCL-2處理可延遲發病時間，顯著提高虹鱒魚存活率。

2 噬菌體跨黏膜轉位

噬菌體在黏膜表面的黏附增加了其與上皮細胞接觸的機會。但由于真核細胞與細菌有著截然不同的細胞受體和胞內機制，普遍認為噬菌體不能感染真核細胞。然而，大量噬菌體療法研究結果表明，在經黏膜的給藥方式下(如口服、鼻內)均可在血液中檢測到噬菌體的存在，隨后跟隨血液轉移到體內各種組織器官，如脾、肝、腎，甚至大腦[15-17]。

關于噬菌體跨越黏膜上皮進入人體內的機制目前有幾種假說[18]：1)“腸漏”假說，腸道患有炎癥時細胞受損，脈管系統被刺破，從而可使噬菌體繞過上皮層；2)“特洛伊木馬”機制，即噬菌體感染或整合進入細菌宿主，而細菌宿主又被吞噬或進入真核細胞，隨后噬菌體裂解宿主菌，釋放子代顆粒；3)噬菌體展示機制，工程化噬菌體被設計展示與某種細胞表面整合蛋白相互補的多肽，進而引起受體介導的內吞作用；4)細胞通過內吞作用自由攝取噬菌體。在一般情況下，噬菌體多是通過第4種途徑，即胞吞作用，進入機體。Nguyen等[19]利用在體外培養的來源于腸、肺、肝、腎和大腦的細胞系，發現噬菌體的胞吞轉運作用在方向上具有對從頂端到基底外側轉運的明顯傾向性，噬菌體顆粒存在于膜結合的囊泡內，并在細胞質內自由漂浮，經過內膜系統轉運，可在所有的亞細胞器內檢測到。囊泡包裹的內化噬菌體顆?？赡茉诎麅缺唤到猓瑢е率删w顆粒和遺傳物質的釋放，其中，遺傳物質可被真核細胞機制轉錄和翻譯[20-21]。

另外，細胞對噬菌體胞吞作用的強弱以及胞吞機制可能與細胞類型以及噬菌體自身特性有關。Tian等[22]在研究絲狀M13噬菌體內化進入上皮細胞系(HeLa細胞系和人乳腺癌細胞系MCF-7)和內皮細胞系(人真皮微血管內皮細胞HDMEC)的機制時發現，M13噬菌體與細胞互作具有細胞類型依賴性，多傾向于附著在上皮細胞的細胞膜上，而不是內皮細胞；M13噬菌體通過內吞進入各類細胞，但對于不同類型細胞表現出不同的內吞機制：通過網格蛋白介導的內吞和巨胞飲作用進入HeLa細胞；通過囊泡運輸、網格蛋白介導的內吞作用和巨胞飲作用進入MCF-7；通過質膜凹陷形成微囊介導的內吞進入HDMEC。Lehti等[23]發現，大腸桿菌PK1A2噬菌體與真核神經母細胞瘤細胞的結合和滲透是通過與該類型細胞表面的聚唾液酸相互作用，其結構與細菌的噬菌體受體相似，并通過內溶酶體途徑內化，可在細胞內存活1 d而不影響細胞的活性，最終噬菌體在溶酶體中降解。

噬菌體在上皮細胞層的胞吞轉運作用為無疾病狀態下人體內噬菌體的出現提供了一種機制上的解釋。成功穿過上皮細胞層的噬菌體可能進入間隙基質，從這里，噬菌體可以流入淋巴系統，隨后能夠進入局部淋巴結、循環系統，最終傳播到全身各個器官，在體內積累形成“體內噬菌體組”[18]。如經尾靜脈注射表達綠色熒光蛋白的T4噬菌體后，可在小鼠的脾和淋巴結內檢測到該種噬菌體的聚集[24]。噬菌體被證明可通過血腦屏障(BBB)，并通過軸突運輸在靈長類動物的大腦中擴散，在腦內積累并介導保護性的抗菌作用[18, 25]。

目前，對噬菌體跨黏膜轉位進入機體的研究仍十分有限，根據細胞種類或噬菌體種類的不同可能存在著更多復雜的機制，因此，需要更多的研究來探索與發現噬菌體與真核細胞之間的互作情況及其機制。

3 噬菌體與機體免疫系統的互作

噬菌體轉位后進入固有層會與黏膜相關淋巴組織相互作用；進一步隨血液遷移到遠處的組織，使之能夠在血液和其他器官或組織中與免疫細胞相互作用。噬菌體屬于外源的免疫原性物質，相應地會刺激機體免疫系統(包括先天性免疫和適應性免疫)，產生促炎或抗炎反應，機體隨即會對這些外源性物質產生免疫反應，如吞噬作用和產生特異性抗體從而清除噬菌體。

3.1 噬菌體與炎癥反應

噬菌體一旦與免疫細胞接觸，就有可能誘導產生不同的抗炎或促炎細胞因子，使之有機會影響機體整體免疫。

3.1.1 抗炎特性 近年來發現，噬菌體在體外具有抑制免疫反應、抗炎癥的特性，似乎與它們的抗菌活性無關，但可能與具體的噬菌體特性以及作用的部位有關。

3.1.1.1 抑制淋巴細胞活化增殖：Mankiewicz等[26]研究表明，經腹腔接種結核菌噬菌體的豚鼠對結核菌素的皮膚反應明顯下降；當添加到淋巴細胞培養物中時，結核桿菌噬菌體可以劑量依賴性地抑制植物血凝素(PHA)誘導的淋巴細胞活化。Górski等[27]證實，T4噬菌體可抑制小鼠模型中同種異體皮膚排斥反應，減少同種異體移植物的免疫細胞浸潤，抑制體外同種異體抗原誘導的免疫球蛋白的產生以及小鼠的特異性抗體反應，并減少小鼠T細胞增殖和NF-κB活化。另有研究證實，一些噬菌體(如T4大腸桿菌噬菌體)可表達結合細胞表面β3整聯蛋白(主要是αIIbβ3)的Lys-Arg-Gly(KGD)序列(位于衣殼蛋白gp24)，從而結合β3+細胞(血小板、單核細胞、一些淋巴細胞和一些腫瘤細胞)，通過抑制整聯蛋白的功能而下調這些細胞的活性[28]。該序列也存在于CD40配體(CD40L)中，已知CD40L可激活內皮和血小板并刺激炎癥，并且對于T淋巴細胞和B淋巴細胞活化至關重要，CD40與CD40L相互作用的中斷具有較強的免疫抑制特性[29]。

3.1.1.2 促進抗炎相關細胞因子的釋放或抗炎標志物基因的表達：Zhang等[30]在體外研究中發現，金黃色葡萄球菌噬菌體vB_SauM_JS25可降低由金黃色葡萄球菌或脂多糖(LPS)誘導的牛乳腺上皮細胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10和RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)的mRNA水平，介導抗炎效果。此外，Van等[31]發現，體外條件下5種不同的高純化噬菌體均可誘導人外周血單核細胞產生明顯的、可重復的免疫反應，抗炎標志物如細胞因子信號轉導抑制分子3 (SOSC3)、IL-1受體拮抗劑(IL1RN)在不同噬菌體處理后均有類似的上調，并且觀察到的免疫反應被證明是不依賴內毒素的，且主要是抗炎癥反應。

3.1.2 促炎特性 噬菌體與免疫系統的互作并不局限于其抗炎特性，有證據顯示，有些噬菌體亦可引起促炎反應。體外試驗表明，金黃色葡萄球菌噬菌體純化制劑A20/R對由絲裂原伴刀豆蛋白A(conA)激活的脾細胞增殖具有共刺激作用，并誘導脾細胞培養物中促炎細胞因子IL-6的產生[32]。Gogokhia等[33]發現，口服純化的大腸桿菌噬菌體，引起無菌小鼠派伊爾氏淋巴結中產生IFN-γ的CD4+T細胞和CD8+T細胞的擴增。體內試驗表明，腹腔注射具有免疫原性的腫瘤特異性W13絲狀噬菌體可使中性粒細胞浸潤，引起小鼠腫瘤消退[34]。進一步的機制分析發現，噬菌體以TLR(toll-like receptors)依賴的方式刺激正常小鼠巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)分泌促炎細胞因子(TNF、IL-6和IL-1)，并增加參與抗原遞呈和共刺激的分子表達，刺激TAMs分泌促進中性粒細胞募集的因子，增強中性粒細胞介導的腫瘤破壞[35]。

盡管絕大部分研究表明噬菌體具有抗炎或促炎的特性，但也存在噬菌體不引起免疫反應的情況。Freyberger等[36]在體外試驗中發現，金黃色葡萄球菌噬菌體K對單核細胞來源的樹突狀細胞的促炎細胞因子和抗炎細胞因子的表達，以及MHC-Ⅰ/Ⅱ和CD80/CD86蛋白的表達幾乎沒有影響，由于樹突狀細胞是先天免疫系統和適應性免疫系統之間最強的抗原遞呈細胞之一，表明噬菌體K不會獨立地影響整體免疫或對其影響非常有限。

3.2 噬菌體與抗病毒先天性免疫

哺乳動物細胞可以通過模式識別受體檢測進入細胞內部的病毒核酸，從而引起抗病毒的先天性免疫反應。這些受體包括感知病毒RNA的TLR-7、TLR-8和RIG-1；感知DNA的TLR-9和GMP-AMP(cGAMP)環化酶，模式識別受體通過識別病毒核酸啟動下游信號級聯反應，從而激活Ⅰ型干擾素、炎性細胞因子(如IL-6和IL-1β)和趨化因子(包括IL-8和CXCL-10)的表達[37]。

噬菌體可能在機體細胞內產生mRNA，進而通過模式識別受體對機體免疫產生干預。如Gogokhia等[33]在體外研究中發現，與噬菌體或噬菌體衍生的DNA共培養的樹突狀細胞可以產生多種細胞因子，包括IL-12、IL-6和IL-10，并通過一種依賴于TLR9但獨立于TLR3的信號轉導刺激CD4+T細胞產生IFN-γ。Sweere等[38]發現，小鼠和人類白細胞可內吞Pf(一種絲狀噬菌體)，使這種單鏈DNA病毒內化，產生噬菌體RNA，從而激活TLR3和干擾素βTIR結構域銜接蛋白(TRIF)依賴性Ⅰ型干擾素的產生，該細胞因子反過來又抑制巨噬細胞產生TNF，從而影響吞噬作用和細菌清除，延緩傷口愈合。

綜合分析目前有關噬菌體對機體免疫影響的研究結果，發現噬菌體更多表現出抗炎特性。噬菌體可能通過降低機體免疫反應，來減少從機體中被清除和降解的機會。噬菌體對免疫系統的影響可能同噬菌體類型、試驗條件(體內/體外)、機體在試驗時所處的狀態(疾病/健康)有關。另外，即使是同一種菌的噬菌體，如上文中提及的不同株金黃色葡萄球菌噬菌體(金黃色葡萄球菌噬菌體vB_SauM_JS25、金黃色葡萄球菌噬菌體純化制劑A20/R、金黃色葡萄球菌噬菌體K)，同是在體外條件下卻表現出不同的結果(抗炎、促炎、無影響)，這可能同試驗中是否存在宿主菌和所用的細胞類型有關。當然，目前關于噬菌體對機體免疫系統影響的研究還很少，仍需要開展更多的研究以揭示噬菌體對機體免疫系統的調節作用。

3.3 噬菌體的清除

吞噬細胞對外來物的一種可能的反應是產生活性氧(ROS)。Borysowski等[45]發現，純化T4噬菌體制劑以劑量依賴的方式增加全血中單核細胞和中性粒細胞活性氧的產生，但與熱滅活的金黃色葡萄球菌細胞相比，噬菌體誘導的呼吸爆發強度要低得多，同時，試驗中另一種噬菌體制劑(A3/R)則并未引起明顯的呼吸爆發，這間接說明了轉位至體內的噬菌體不太可能引起組織器官的氧化損傷。但噬菌體對于由細菌誘導的呼吸爆發具有重要影響，研究發現，T4噬菌體可以顯著降低不同大腸桿菌中脂多糖(LPS)以及活菌誘導的外周血多形核白細胞(PMNs)活性氧的產生，并且這種效應不依賴于細菌對T4介導的裂解的敏感性[46-47]。噬菌體介導的該種效應，可防止由細菌誘導產生的過量活性氧對機體造成氧化應激和組織損傷。

3.3.2 噬菌體中和抗體 正常機體血液內天然存在噬菌體中和抗體[48]，這可能是由于持續的外源噬菌體向體內轉位造成的[19]。噬菌體是外源的免疫原性物質，能刺激體液免疫反應，誘導產生噬菌體抗體，但噬菌體的免疫原性較弱，機體免疫系統可產生低濃度的噬菌體中和抗體而不引起炎癥反應。Majewska等[15]發現，長期在小鼠飲水中加入高滴度的T4噬菌體(4×109pfu·mL-1)可以激活體液免疫，誘導腸內特異性的分泌型IgA反應和血清IgG反應，但該免疫刺激反應相對較弱。因此，在醫學上，基于這種低免疫原性，可通過免疫接種噬菌體檢測T細胞功能及噬菌體特異性抗體的產生來評估免疫缺陷患者的免疫能力[49]。

除了將整個噬菌體視為一個整體外，評價單個噬菌體蛋白引起的免疫反應同樣具有意義。D?browska等[48]在正常人群血液中發現了針對T4噬菌體蛋白gp23*、gp24*、Hoc和Soc的天然IgG抗體，其中，針對T4主要衣殼蛋白(gp23*)的特異性抗體占優勢，而并不是高抗原性的外衣殼蛋白Hoc；另外，在分析這4種頭部蛋白各自的免疫原性時發現，IgM和IgG抗體主要是由gp23*和Hoc誘導的，由此，作者認為，這兩種蛋白是對噬菌體免疫記憶起顯著作用的頭部蛋白。另一針對T4噬菌體的不同結構蛋白對于體液免疫影響的試驗發現，噬菌體T4 Hoc蛋白和gp12強烈刺激IgG(血液)和IgA(腸道)抗體的產生，具有高免疫原性，而gp23*、gp24*和Hoc只誘導了較低的抗體產生[15]。以上兩個針對T4噬菌體蛋白試驗結果的差異可能是由于不同的給藥途徑造成的，前者是通過腹腔注射不經過腸道，而后者是經口給藥，說明噬菌體蛋白乃至噬菌體給藥途徑不同都會對機體抗體的產生造成影響。

4 小 結

目前，對人及動物體內噬菌體組的研究依然處于初級階段，大量新型噬菌體還有待發現，對噬菌體黏附于黏膜和轉位機制、對噬菌體進入體內之后與免疫細胞的互作及這種現象對機體的潛在影響，更是需要大量的工作來提供數據支持。此外，還需要進一步的研究來闡明噬菌體在機體細胞內的運輸和釋放機制以及可能發生的信號轉導，為在細胞水平、分子水平研究噬菌體提供理論參考。深入了解噬菌體在黏膜與菌群和動物宿主的互作將會為人們理解和調控黏膜免疫系統乃至調控機體免疫狀態提供理論依據。