豬RXRB基因SNPs檢測及其與生長育肥和繁殖性狀的關聯分析

彭雅鑫，劉 軍，趙詩瑜，徐在言，左 波*

(1.華中農業大學 農業部豬遺傳育種重點實驗室，武漢 430070； 2.華中農業大學動物醫學院 基礎獸醫系，武漢 430070)

隨著高通量測序技術的飛速發展和測序成本的降低，國內外許多研究人員利用豬的高密度芯片對豬重要經濟性狀進行了GWAS研究，鑒定出大量的SNPs標記、QTLs和候選基因，為豬的遺傳育種提供了必要的分子基礎[1]。其中，SNP分子標記多態性高、密度大、遺傳穩定性高、易于實現自動化高通量基因分型，在表型與基因型關聯性研究中起重要作用[2]，因而被廣泛應用于人類和動植物各項遺傳學研究，包括遺傳圖譜構建、連鎖分析、關聯分析、基因組預測等[3]。分子遺傳標記與動物分子育種技術加快了品種改良和新品系培育速度[4]。目前，SNP的應用已成為了研究豬遺傳育種領域不可或缺的工具之一。

視黃酸X受體β(retinoid X receptor beta,RXRB)基因定位在豬7號染色體上，由10個外顯子和9個內含子組成。視黃素X受體(retinoid X receptor, RXR)是一種能使視黃酸受體(retinoic acid receptor, RAR)發揮正常作用的輔助蛋白，它與RAR可形成異源二聚體，使RAR與其配體更容易結合，從而增強RAR的轉錄和與配體的親和力[5-7]，也可以通過與其他核激素受體形成二聚體來激活多種功能，從而促進不同信號通路的活動[8]。RXR作為一種轉錄因子，屬于核轉錄調節因子超家族一員，該家族還包含了維生素D受體、甲狀腺激素受體、類固醇激素受體以及所謂的孤兒受體。自1990年RXR被分離并鑒定為核受體超家族成員以來，人們對核受體的生理調節產生了新的認識，從生物學上講，RXR通過與過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)和肝X受體(LXR)等其他核受體結合形成異二聚體，發揮關鍵作用[9-10]。研究發現，RXR既可以與其他核受體形成異源二聚體啟動轉錄，也可以以同源二聚體形式啟動轉錄[11]。通過不同的結合體在細胞質和核中定位不同，從而在調控細胞增殖、分化和凋亡中發揮重要作用[12]。目前，已知RAR受體家族是由全反式視黃酸(all-trans retinoic acid, at-RA)和9-順式視黃酸(9-cis-RA)激活的，而RXR受體家族僅由9-cis-RA激活，表明9-cis-RA對RAR/RXR的形成是必需的[13]。

RXRB作為視黃酸的一個編碼基因，可以介導視黃酸的生理活性。Kastner等[14]研究發現，在RXRB基因突變和缺乏RXRB的小鼠中約有50%在出生前或出生時死亡，而幸存的雄性小鼠因其精子發生異常而不育。另外，RXRB無效突變導致Sertoli細胞脂質代謝異常和精子發生異常[15]。Mascrez等[16]進一步研究發現，Sertoli細胞中的膽固醇穩態取決于TIF2共激活因子和RXRB/LXRB異二聚體。另有研究報道，在Sertoli細胞中RXRB基因的體細胞靶向性失活可導致精子釋放失敗，膽固醇蓄積并隨后使睪丸變性[17]。在表達模式上，有研究發現，RXRB基因mRNA在不同日齡大白豬的心、腎、脾、大腸、子宮、卵巢中持續表達，其中在大腸、子宮和卵巢中持續高表達[18]。黃銳等[19]以長白山野豬和東北民豬為材料，檢測了RXRB基因在不同骨骼肌組織中mRNA表達量，結果發現，該基因在兩個品種豬肌肉組織中的表達量普遍高于非肌肉組織，表明RXRB可能是影響豬肉品質的候選基因之一。Pena等[20]利用高密度SNP陣列對382頭伊比利亞豬進行GWAS分析，篩選到了與肌內脂肪中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量密切相關的候選基因RXRB。以上這些研究都表明了RXRB基因可能與動物的生長繁殖性能相關。本研究將RXRB基因，作為候選基因研究其多態性與豬重要經濟性狀的相關性，以期篩選到與豬生長、繁殖性狀顯著相關的SNPs，為今后種豬遺傳改良提供新的遺傳標記位點。

1 材料與方法

1.1 試驗豬群及性狀測定

本研究樣本采集及數據收集于浙江省某企業。選取來自不同血緣世代且生長健康的后備大白豬作為研究對象，將豬群按品系分為美系大白豬和法系大白豬，其中美系大白豬共459頭(公豬85頭，母豬374頭)，法系大白豬共503頭(公豬18頭，母豬485頭)，上述試驗豬群的飼養環境和管理方式一致。通過對試驗豬群進行前腔靜脈采血，并利用血液基因組DNA中量提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA，將樣品DNA保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。測定的表型性狀主要包括：達100 kg體重日齡(d)、活體背膘厚(mm)、初生重(kg)、體長(cm)、眼肌面積(cm2)、左乳頭數和右乳頭數。其中，當豬的體重達到(100±5) kg時，利用B型超聲設備(ESAOTE，Mylob Touch VET)測定豬活體背膘厚和眼肌面積，活體背膘厚和眼肌面積測定位置在豬倒數第3、4根肋骨距離背中線4～5 cm處。所有測量數據由育種軟件GBS 5.0校正后得到。

1.2 引物設計及PCR擴增

根據NCBI中GenBank上提供的豬RXRB基因序列(登錄號為NC_010449.5)，應用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，并由上海生工生物工程技術有限公司合成。所用引物及目的片段長度如表1所示。PCR擴增反應總體積為20.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Taq PCR Mix 10.0 μL，ddH2O 8.0 μL，正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。 PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，退火 30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸，共36個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5 μL的DNA Marker DL2000作為參照。電泳結束后利用凝膠成像系統觀察擴增結果。

表1 RXRB引物序列

1.3 PCR產物酶切反應體系及條件

在本研究中檢測到的10個SNPs中，僅多態性位點rs326226767存在合適的酶切位點，可利用PCR-BglⅠ-RFLP方法對該位點進行基因分型。其余9個SNPs則利用直接測序法進行基因分型。測序結果用Chromas軟件查看。酶切反應體系及條件：PCR產物酶切反應體積為20.0 μL，其中10×FastDigest Green Buffer 2.0 μL，限制性內切酶0.5 μL(5 U)， ddH2O 7.5 μL，PCR 產物10.0 μL，將樣品混勻后離心，37 ℃酶切1 h。酶切產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5 μL的DNA Marker DL2000作為參照。電泳結束后利用凝膠成像系統觀察基因型。

1.4 數據處理與統計分析

1.4.2RXRB基因各SNPs位點的連鎖不平衡分析 本研究利用Haploview 4.2軟件分析RXRB基因SNPs位點之間的連鎖不平衡水平并計算出各單倍型頻率。

1.4.3 分子標記的基因效應分析 本研究利用SAS 8.0軟件中的混合線性模型(Mixed)進行多態性位點不同基因型和單倍型組合與豬生長繁殖性狀表型值之間的關聯分析，結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05判定為差異顯著，P<0.01判定為差異極顯著。應用Excel軟件分別計算基因型頻率和等位基因頻率，并進行χ2檢驗，分析其是否偏離Hardy-Weinberg平衡狀態。分析模型：Tijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Bl+eijklm。式中，Tijkl為性狀表型值；μ為平均值；Gi為基因型效應；Fj、Sk、Bl為固定效應，分別為家系、性別、批次效應，eijklm為殘差效應。

2 結 果

2.1 PCR擴增與酶切產物的電泳檢測

將引物P1、P2和P3分別在美系大白豬和法系大白豬DNA混合池中進行PCR擴增，并將PCR產物送至上海生工生物工程技術有限公司進行測序。結果發現，在美系大白豬中，引物P1擴增產物檢測到4個SNPs，分別為第一外顯子區域的rs340542491、rs324141460和第一內含子區域的rs330162688、rs325538588；引物P2擴增產物中檢測到1個SNP(rs326226767)，位于第七外顯子區域，且該位點由堿基G突變成堿基A，進而導致限制性內切酶BglⅠ酶切位點的改變，可采用PCR-BglⅠ-RFLP方法來進行基因型分型，酶切電泳結果見圖1。在法系大白豬中，引物P3擴增產物檢測到5個SNPs，分別為第八內含子區域的rs691889709、rs336609453，第九外顯子區域的rs80789331，第九內含子區域的rs332169586，第十外顯子區域的rs323107853。上述10個SNPs的測序峰圖如圖2所示。

2.2 大白豬RXRB基因10個SNPs的遺傳多態性分析

利用直接測序法分別檢測了459頭美系大白豬中引物P1擴增區域內的4個SNPs和503頭法系大白豬中引物P3擴增區域內的5個SNPs，同時利用PCR-BglⅠ-RFLP技術對418頭美系大白豬中引物P2擴增區域內的1個SNP(rs326226767)進行了基因分型。上述10個SNPs均檢測到3種基因型，基因型與等位基因頻率分布見表2。X2適合性檢驗結果表明，上述10個SNPs在大白豬群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。

M. DNA相對分子質量標準；1、2、5. GG基因型；3. AA基因型；4、6、7. GA基因型 M. DL2000 marker; 1, 2, 5. GG genotype; 3. AA genotype; 4, 6,7. GA genotype圖1 RXRB基因引物P2擴增片段的PCR-Bgl Ⅰ-RFLP酶切分型結果Fig.1 The PCR-Bgl Ⅰ-RFLP results of amplified fragments by primer P2 in RXRB gene

圖2 RXRB基因SNPs測序結果Fig.2 SNPs sequencing results in RXRB gene

從群體遺傳學角度分析大白豬RXRB基因SNPs的基因型和等位基因，由表2可知，除位點rs80789331的多態性含量(PIC)為0.133，屬于低度多態(PIC<0.25)，其余9個SNPs均屬于中度多態(0.25

2.3 大白豬RXRB基因多態性與生長育肥和繁殖性狀的關聯分析

從大白豬RXRB基因多態性與經濟性狀的關聯分析(表3)可以看出，在達100 kg體重日齡中，位點rs340542491、rs330162688和rs326226767均存在顯著的關聯性(P<0.05)；在活體背膘厚中，位點rs340542491和rs330162688的GG基因型個體的背膘厚度均顯著大于GA和AA基因型(P<0.05)，GA和AA基因型個體間無顯著差異(P>0.05)，表明了等位基因G會降低瘦肉率，為不利等位基因，同時，位點rs336609453和rs332169586也存在顯著的關聯性(P<0.05)；在初生重中，位點rs340542491和rs325538588存在顯著的關聯性(P<0.05)，且GA基因型個體相比于其他基因型的初生重更大，在實際生產過程中初生重越大的仔豬通常具有更高的成活率，即GA基因型為有利基因型，同時，位點rs691889709和rs323107853也存在顯著的關聯性(P<0.05)；在體長中，位點rs324141460的GA基因型個體顯著大于GG基因型(P<0.05)；在眼肌面積中，位點rs325538588的AA基因型個體顯著大于GG和GA基因型(P<0.05)，位點rs80789331的AA基因型個體顯著大于CC和CA基因型(P<0.05)；在乳頭數中，位點rs340542491和rs330162688的AA基因型個體的左乳頭數均極顯著高于GA基因型(P<0.01)，位點rs324141460的AA基因型個體的左、右乳頭數均極顯著高于GG和GA基因型(P<0.01)，位點rs336609453的AA基因型個體的右乳頭數顯著高于AG基因型(P<0.05)， 位點rs332169586的GG基因型個體的右乳頭數顯著高于GA基因型(P<0.05)，通常情況下，母豬的乳頭數越多，其繁殖性能越強。另外，通過對兩個品系豬表型值數據的統計分析發現，法系大白豬的平均體長和平均乳頭數均要高于美系大白豬，這可能是不同的選育方向造成了兩個品系豬群的差異。

表2 RXRB基因10個 SNPs 位點的基因型及等位基因頻率

2.4 RXRB基因10個SNPs連鎖不平衡及單倍型分析

利用Haploview 4.2軟件分別對美系大白豬和法系大白豬RXRB基因內處于Hardy-Weinberg平衡狀態的10個SNPs進行連鎖不平衡及單倍型分析。如圖3所示，在美系大白豬中的5個SNPs可組成一個單倍型模塊，其中,rs326226767-rs325538588處于強連鎖不平衡狀態(D’=0.96，r2=0.91>0.33)，rs330162688-rs324141460處于完全連鎖狀態(D’=1)，rs324141460-rs340542491處于完全連鎖狀態(D’=1)；在法系大白豬中的5個SNPs也可組成一個單倍型模塊，其中,rs691889709-rs323107853處于完美連鎖狀態(D’=1，r2=1)，這也解釋了該2個 SNPs基因型頻率和關聯分析結果一致性問題。如表4和表5所示，美系大白豬和法系大白豬中的SNPs各能形成4種單倍型，分別將4種單倍型進行組合，剔除頻率小于0.03的組合后，在美系大白豬中可產生8種雙倍型，法系大白豬中可產生6種雙倍型，并分別進行下一步的關聯分析。

由表6可知，美系大白豬RXRB基因產生的8種 雙倍型在達100 kg體重日齡、活體背膘厚、初生重和左乳頭數等性狀上存在極顯著(P<0.01)或顯著差異(P<0.05)，對于達100 kg體重日齡、活體背膘厚和初生重性狀，在生產實踐中H1-H3為有利雙倍型；對于左乳頭數性狀，H2-H2為有利雙倍型。而法系大白豬RXRB基因產生的6種雙倍型在體長和右乳頭數性狀上存在極顯著(P<0.01)或顯著差異(P<0.05)，其中D1-D1個體能極顯著提高右乳頭數(P<0.01)，但極顯著降低了體長(P<0.01)， 因此需要根據實際情況進行選留。

根據D’值和r2判斷位點之間是否存在連鎖，其中D’=1稱之為完全連鎖，D’=0為無連鎖或連鎖平衡，r2=1稱之為完全連鎖，r2>0.33 提示為強連鎖，r2=0為無連鎖或連鎖平衡 The linkage among SNPs was evaluated by the value of D’ and r2, where D’ = 1 indicated full linkage， D’ = 0 indicated no linkage or linkage equilibrium, r2 = 1 indicated full linkage, r2>0.33 indicated strong linkage, r2=0 indicated no linkage or linkage equilibrium圖3 RXRB基因10個SNPs位點連鎖不平衡分析Fig.3 The linkage disequilibrium analysis among 10 SNPs of RXRB gene

表4 RXRB基因單倍型及其頻率

表5 RXRB基因單倍型組合及其頻率

3 討 論

3.1 RXRB基因群體遺傳特征分析

在自然選擇下，人工選擇干預、遺傳漂變等因素都會導致動物的一些核苷酸發生改變，從而使生物的遺傳性狀變得更加豐富多樣[21]。群體遺傳變異度的大小代表著群體遺傳豐富度的高低，一般來說，群體遺傳變異度越高，則群體遺傳豐富度也越高，多態信息含量(PIC)常用來指示這一指標[22]。本研究中，除rs80789331外，其余9個SNPs均屬于中度多態(0.25

3.2 RXRB基因多態性與生長繁殖性狀的關聯分析

相關研究表明，RXRB基因作為核轉錄調節因子超家族一員，在生物體的胚胎發育、器官形成、細胞分化、細胞凋亡和維持生殖功能等方面具有重要作用[26]。李華振等[27]總結前人研究結果得出，RXRs參與組成的二聚體對動物繁殖發揮著多種重要的調控作用，但目前RXRs組成的二聚體在發情周期和季節性發情中具體的分子機制不夠明晰。在支持細胞中，RXRB基因的表達能夠維持膽固醇的穩態與精子形成[28]。成年哺乳動物體內都存在白色脂肪(WAT)和棕色脂肪(BAT)，WAT的主要作用是將體內多余能量以脂肪的形式儲存起來，過多的WAT會形成肥胖，而BAT能夠將脂肪轉化為熱量，加強新陳代謝，促進白色脂肪消耗[29]。有研究表明，在大鼠脂肪組織中，WAT和BAT表達RAR和RXR亞型有著不同的方式，并且在不同的哺乳動物中都有相似的表達差別[30-31]。本研究發現，在美系大白豬群體中檢測到的RXRB多態性位點rs340542491和rs330162688均與活體背膘厚性狀顯著相關，且GA和AA基因型均為有利基因型；在法系大白豬群體檢測到的RXRB多態性位點rs336609453和rs332169586均與活體背膘厚性狀顯著相關，且雜合子基因型均為不利基因型，以上4個 SNPs位點均可以作為降低大白豬活體背膘厚，提高瘦肉率的潛在分子標記。除此之外，我們發現在美系大白豬中RXRB基因rs325538588位點的AA基因型個體的眼肌面積顯著大于GG和GA基因型個體，但AA基因型個體的初生重顯著小于GA基因型個體，雖然AA基因型能顯著增加眼肌面積，但是會降低初生重，可能會影響仔豬成活率，因此在生產實踐中，需要根據實際情況進行選留。

有研究發現，PPAR-γ/RXR異二聚體在鼠胎盤發育中起著關鍵的調節作用[32]。RXR基因在哺乳動物下丘腦-垂體-卵巢軸中表達，能作為連接動物繁殖發育和生理發情過程的關鍵轉錄因子[33]。另有研究發現，RXR基因表達與綿羊的繁殖有關，可能參與綿羊季節性發情上游基因調控[34]。另有研究報道，產仔數與總乳頭數呈正相關[35]。通過與繁殖性狀的關聯分析發現，在美系大白豬中RXRB基因多態性位點rs340542491、rs324141460和rs330162688與左乳頭數性狀均達到極顯著相關，AA基因型均為有利基因型；在法系大白豬中RXRB基因多態性位點rs336609453和rs332169586與右乳頭數性狀均達到顯著相關，以上5個SNPs 可作為提高母豬乳頭數性狀的候選位點，為母豬繁殖力提供新的分子標記和理論依據。

表6 RXRB基因單倍型組合與生長育肥和繁殖性狀的關聯分析

在以往的研究中，一般認為基因突變發生在內含子不會影響生物性狀，發生在其他區域則可能影響生物性狀，但隨著研究者們的深入研究發現，真核生物中內含子參與基因剪切，內含子突變可能導致剪切準確性或效率發生變化，從而導致氨基酸編碼改變，最終改變真核生物表型，如IGF2基因第三內含子3072位點的G/A突變可影響其與ZBED6轉錄因子的結合，進而改善巴馬豬的肉產量[36]。即使內含子突變沒有造成對應氨基酸的改變，但其可能會改變調控剪接的外顯子基序，導致剪接位點失活；另外，有些內含子含有增強子序列，其可促進基因的專一性轉錄，從而對動物的表型產生影響[37]。本研究在兩個品系豬群中共鑒定出5個位于RXRB內含子區域的SNPs(rs330162688、rs325538588、rs691889709、rs336609453和rs332169586)，并且這5個SNPs分別與大白豬性狀表型值有顯著或極顯著的關聯。這5個SNPs是因果突變位點，還是僅與因果突變位點緊密連鎖的分子標記，還需進行后續功能驗證來闡明其遺傳機理。

3.3 RXRB基因單倍型分析

動物基因對表型的影響可能受到多個突變位點的共同作用[38]。研究發現，由于強關聯SNPs直接可以互相隨機替代，單個SNP分析作用較小，而單倍型可以提供比單個SNP更為豐富的信息量，單倍型分析對于單染色體上雜合SNP的定位、疾病基因的挖掘和疾病治療新方法的尋找有重要作用[39]。構建單倍型前需要進行LD分析，連鎖不平衡常用D’和r2度量，當D’=0，r2=0時說明處于完全連鎖平衡狀態，當D’=1，r2=1時說明處于完全連鎖不平衡狀態。先前有研究表明，等位基因效應在不同品系豬中存在差異，推測是由于不同品系豬的連鎖區間和隨機突變不同所引起的[40-41]。在本研究的美系大白豬和法系大白豬中，分別對符合Hardy-Weinberg平衡的10個SNPs進行了連鎖不平衡分析發現，美系大白豬中單倍型組合關聯分析結果與單個SNP關聯分析結果一致，均與達100 kg體重日齡、活體背膘厚、初生重和乳頭數性狀達到顯著相關；但法系大白豬中單倍型組合關聯分析結果顯示出不同雙倍型個體間的體長具有極顯著差異，這與單個SNP關聯分析結果不一致，考慮到該研究的樣本量，有些單倍型所占比例太小，產生的試驗結果具有一定的誤差，后期還需進一步擴大樣本量來驗證。

4 結 論

本研究檢測到RXRB基因內的10個SNPs，對大白豬達100 kg體重日齡、活體背膘厚、初生重和乳頭數等性狀均具有顯著的遺傳效應，表明RXRB基因可以作為影響豬生長繁殖性狀的候選基因，上述10個SNPs可以作為豬育種改良的分子標記，同時為深入研究該基因功能具有一定的參考意義。