雜交組合斷奶仔豬腹瀉與FUT1基因遺傳變異的關聯分析

方 晨，郭 飛，胡瑞舉，楊明華，張 斌，劉韶娜，黃 英，趙彥光*，趙素梅*

(1. 云南農業大學 云南省動物營養與飼料重點實驗室，昆明 650201； 2.云南省畜牧獸醫科學院，昆明650224)

斷奶仔豬腹瀉是由多種因素引起的急性、致死性傳染病。腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)F18通過黏附于仔豬小腸黏膜上皮細胞的受體蛋白釋放腸毒素，引起仔豬斷奶前后腹瀉和水腫[1-2]。α(1，2)巖藻糖轉移酶基因1(α-1，2-fucosyltransferase gene，FUT1)是調節大腸桿菌F18黏附受體表達的一個候選基因[3]，位于豬6號染色體的6q11 區段，與仔豬的腹瀉和水腫有關[4-6]。相關研究表明，FUT1基因與豬的腹瀉、產仔性能、發育性狀等相關[7-14]。

雜交技術作為豬育種的重要手段之一，不僅集合多個豬品種的優勢，還可以產生雜種優勢，提高品種的生產性能和經濟價值。二元雜交指利用兩個品種或品系的公母豬進行雜交，簡單易行，又稱為簡單雜交[15]。外來豬種具有瘦肉率高、生長快、屠宰率高等特點，地方豬種在長期馴養中已適應當地氣候環境，具有繁殖力高、抗病力及抗逆性強、耐粗飼、遺傳力穩定、雜交優勢明顯等優勢特征[16]。迪慶藏豬、滇南小耳豬是云南省優良的地方品種，迪慶藏豬多位于高原嚴寒地區，滇南小耳豬多生長在熱帶和亞熱帶高溫潮濕地區，均具有抗逆性強、肉品質好等優點[17-18]。二元豬有明顯的雜交優勢，生長速度快，育肥效果好[19]。杜滇豬、杜藏豬是以國外引進豬種杜洛克豬為父本，分別以地方豬種滇南小耳豬、迪慶藏豬為母本進行雜交組合獲得的二元雜交豬。以地方豬為核心的配套系生產模式既能改善地方豬生產性能偏低的問題，又能有效地保護珍稀地方豬種遺傳資源，保留地方豬優良特性，是兼顧市場與遺傳資源保護的重要舉措[20]。

標記輔助選擇法(marker-assisted selection，MAS)為豬抗病性狀的選育提供了一種新的方法，利用影響抗病性能的主效基因進行分子標記輔助育種是提高抗病力性狀遺傳進展的有效途徑[21]。本試驗以杜滇、杜藏和杜洛克斷奶仔豬為研究對象，通過研究FUT1基因多態性與斷奶仔豬腹瀉的關系，探究與抗病育種相關的候選基因和遺傳標記，為選育優良的抗病豬種提供一定的理論依據，減少抗生素在臨床上的使用并有效控制病發率，提高仔豬成活率，增加養殖業經濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗在云南省畜牧獸醫科學院養豬與動物營養研究所豬場進行，選擇35日齡8 kg左右體重的斷奶仔豬365頭，其中杜藏豬(杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀)113頭、杜滇豬(杜洛克豬♂×滇南小耳豬♀)165頭、杜洛克豬(杜洛克豬♂×杜洛克豬♀)87頭。

1.2 試驗日糧及飼養管理

試驗日糧配方參照中國豬飼養標準，日常飼養管理及試驗步驟均按照動物倫理委員會制定的《實驗動物倫理與使用指南》執行。

1.3 樣品采集

試驗豬出生后1 d內采集耳組織，并放入裝有酒精的2 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.4 腹瀉統計

試驗期為14 d，每天觀察斷奶仔豬腹瀉情況，記錄腹瀉頭數，統計輕、中、重度腹瀉率、總腹瀉率和腹瀉指數。

根據糞便評分標準記錄腹瀉情況：正常情況，糞便干燥記0分；輕度腹瀉，軟糞且呈形記1分；中度腹瀉，糞便液樣呈灰色或黃色記2分；重度腹瀉，糞便水樣呈噴射狀記3分。

腹瀉率的計算：腹瀉率=試驗期腹瀉仔豬頭次/(試驗仔豬頭數×試驗天數)×100%；腹瀉指數=稀便率×平均稀便級(稀便率為每只斷奶仔豬所排的稀便數與總便數之比。稀便級表示每只斷奶仔豬稀便的程度)。

1.5 基因組DNA提取

參照試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書進行DNA的提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，核酸濃度檢測儀測定基因組DNA濃度，并稀釋到50 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。

1.6 引物設計及合成

根據豬FUT1基因的全序列(GenBank登錄號：NC_010448.4)，用Primer3在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設計引物(表1)，設計的引物由Invitrogen公司合成。

表1 FUT1基因分段擴增引物

1.7 PCR擴增及測序

PCR擴增反應體系20 μL：Template(10×)2 μL， 上、下引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Taq PCR Master Mix(10 mmol·L-1)12.5 μL(擎科生物有限公司)，ddH2O 3.5 μL。PCR產物由通用生物公司測序，FUT1基因PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個循環；72 ℃延伸7 min。

1.8 統計分析

2 結 果

2. 1 PCR擴增產物檢測

PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。FUT1基因擴增產物條帶單一、清晰明亮，與預期片段大小相符，符合DNA 測序的要求(圖1)。

2.2 FUT1多態位點檢測及基因型判定

將6段測序序列拼接，得到FUT1基因全長3 045 bp。 將測序結果與豬FUT1基因全序列比對，共發現4個SNPs位點，3個突變位點發生錯義突變。其中，第一外顯子18 bp處堿基T→C(T18C)，存在CT和TT 2種基因型；第二外顯子中，229 bp堿基C→T(C229T)，亮氨酸轉變為苯丙氨酸，有CC、CT和TT 3種基因型；2 418 bp堿基C→A(C2418A)，亮氨酸轉變為甲硫氨酸，為CC、CA 2種基因型；306 bp堿基A→G(A306G)，蘇氨酸轉變為丙氨酸，有AA、AG和GG 3種基因型。

M. DNA相對分子質量標準；A、B、C、D、E、F. FUT1-1、2、3、4、5、6 PCR擴增產物 M.D2000 Marker; A, B, C, D, E, F. PCR amplification products of FUT1-1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively圖1 FUT1基因PCR擴增產物結果Fig.1 Results of PCR amplification products of FUT1 gene

2.3 FUT1基因型頻率和等位基因頻率分析

多態性和雜合度方面，4個突變位點均為中度。χ2適合性檢驗結果表明，除T18C位點、杜藏豬的C2418A位點外，其他突變位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。T18C位點處，杜藏豬、杜滇豬CT基因型頻率最高，杜洛克豬TT型最高；C229T位點上，杜藏豬和杜滇豬均以TT為主要基因型，杜洛克豬以CT為主要基因型；杜藏豬C2418A位點的AC和CC基因型頻率相同，杜滇豬和杜洛克豬CC基因型為優勢基因型；A306G位點與C229T位點基因型頻率和等位基因頻率數值一致，可能存在遺傳關聯反應(表2)。

2.4 FUT1突變位點基因型與腹瀉率關聯性分析

T18C位點中，杜滇豬、杜藏豬TT基因型的各項腹瀉指標(除杜藏豬的輕度腹瀉率外)均高于CT型，但杜洛克豬CT型的各項腹瀉指標均高于TT型，其中的總腹瀉率差異極顯著(P<0.01)；C229T位點處，除了杜滇豬的重度腹瀉率，其他豬CC型的腹瀉指標均高于CT、TT型，其中的總腹瀉率呈顯著差異(P<0.05)；在C2418A位點，除杜滇豬外，其余兩種豬AC型的腹瀉指標均高于CC型，杜洛克豬部分指標為差異極顯著(P<0.01)；A306G位點與C229T位點的腹瀉指標結果相同，可能存在關聯反應(表3)。

3 討 論

遺傳和環境兩大因素會共同導致動物疾病的發生[22]。個體對環境中致病因子易感性(或抗性)的遺傳基礎為基因組結構差異或者其表達水平的差異[23]。羅艷茹[24]發現，長白、大白和松遼黑豬在FUT1基因第307位均存在多態，檢測到GG、AG和AA 3種基因型，G為優勢等位基因，且3種基因型之間存在差異。朱弘焱等[25]研究發現，荷包豬、長白豬、大白豬、大長雜交豬的FUT1 基因型分布趨勢為AA

表2 杜藏豬、杜滇豬和杜洛克豬FUT1基因SNP位點的基因型分布和等位基因頻率

表3 FUT1基因多態性位點各基因型的腹瀉率結果

斷奶仔豬易患腹瀉和水腫病，是引起斷奶仔豬死亡的重要病因[26]。豬腸毒素型大腸桿菌引起的仔豬腹瀉和水腫病是由于大腸桿菌F18的兩個亞基黏附在其小腸黏膜上皮細胞上并產生腸毒素而引起的[27-30]。吳圣龍等[31-32]證實，FUT1基因的M307位點多態性與斷奶仔豬腹瀉和水腫病存在直接的相關性，且抗病性AA基因型不僅對斷奶仔豬腹瀉具有抗性，且具有較高的一般抗病性。FUT1基因第307 bp的堿基G突變為A，發生錯義突變，導致其編碼產物第103位氨基酸由丙氨酸變為蘇氨酸，使該酶活性發生改變，抑制ETEC F18黏附仔豬小腸，因此FUT1基因AA基因型的豬能抵抗ETEC F18感染，AG和GG基因型的豬則易感。周利華等[33]通過對10個國內外豬種FUT1基因新cSNPs的鑒別以及仔豬抗大腸桿菌F18侵染研究，發現 M229C/T和M714T/C兩個位點，M714位點為同義突變，M229位點引起亮氨酸轉變為苯丙氨酸，FUT1基因M229位點可能是決定中國地方豬水腫與腹瀉病的變異位點，這與本研究結果一致。除了C229T突變位點外，本試驗還發現了T18C、C2418A、A306G 3個新突變位點，可能是影響豬抗腹瀉病的關鍵位點。C2418A、A306G也引起氨基酸變化，可能會造成FUT1酶活性改變，進而控制豬腸毒素大腸桿菌F18對仔豬小腸的黏附。T18C、C229T、C2418A、A306G位點作為標識斷奶仔豬腹瀉的分子標記需進一步深入研究。

FUT1基因對斷奶豬腹瀉的影響程度因品種或品系的不同而有所差異[34-40]。杜滇豬、杜藏豬作為雜交豬，其T18C位點的中、重度腹瀉率均值，C229T和A306G位點的腹瀉指數均值以及C2418A位點的重度腹瀉率均值均低于外來豬種杜洛克豬，呈現一定的雜種優勢和較好的抗病力。通過研究3種斷奶仔豬FUT1基因多態性與腹瀉的關系發現，其FUT1基因SNP位點的不同基因型對腹瀉的影響存在差異。T18C位點TT基因型的杜滇和杜藏雜交豬、C229T位點的CC基因型、C2418A位點的CA基因型和A306G的GG基因型的3種豬腹瀉程度相對較嚴重，對 ETEC F18敏感，呈顯性遺傳，其他基因型表現為抗性，呈隱性遺傳。后期可在育種時關注抗性基因型個體的引入，期望提高該品系仔豬抗腹瀉病的性能。

4 結 論

品種和FUT1基因多態性對斷奶仔豬腹瀉的影響有一定的差異性和相關性。地方雜交組合杜滇豬、杜藏豬和杜洛克豬FUT1基因存在4個突變位點，均處于中度多態和雜合度，遺傳變異較為豐富。突變位點中3個為錯義突變，可能是決定豬群抗腹瀉病的關鍵位點，后續可繼續深入研究其相關編碼蛋白結構功能，為分子抗病育種提供更堅實的理論基礎。