豬類無(wú)精癥缺失基因DAZL的cDNA全長(zhǎng)克隆、組織表達(dá)和亞細(xì)胞定位

王 配，王麗娜，霍海龍，張 霞，趙 筱，王雪飛，霍金龍*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201； 2. 云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 650212)

雄性動(dòng)物睪丸生精上皮細(xì)胞內(nèi)的精子形成是一個(gè)極為復(fù)雜、精細(xì)調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程，涉及精原細(xì)胞的有絲分裂、精細(xì)胞的減數(shù)分裂以及功能性精子的形成等一系列細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程，受眾多基因參與調(diào)控[1-5]。類無(wú)精癥缺失基因(deleted in azoospermia like，DAZL)最早由Reijo等[6]報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其和男性不育高度相關(guān)，屬于DAZ家族中的主要成員，該家族由位于常染色體上的BOLL和DAZL以及位于Y染色體上的DAZ三個(gè)成員組成，在物種間高度保守，通過(guò)其產(chǎn)物RNA結(jié)合蛋白發(fā)揮重要功能[7-8]。DAZL特異表達(dá)于雄性動(dòng)物睪丸組織，在早期胚胎發(fā)育、初級(jí)精母細(xì)胞形成和分化及睪丸發(fā)育過(guò)程中精母細(xì)胞的減數(shù)分裂中發(fā)揮重要功能[9]。此外，DAZL還能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化[10-11]，影響精子的數(shù)量、活力和形態(tài)[12]。因此，DAZL能調(diào)節(jié)人、大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生，調(diào)控性細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響其生殖生理[13-14]，DAZL還能影響mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)/定位或翻譯以及激活原本翻譯沉默的特異生殖細(xì)胞的mRNA，從而控制生殖細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和成熟[15]。DAZL不僅影響雄性，而且對(duì)雌性動(dòng)物的生殖也有影響，能在雌性動(dòng)物卵巢中表達(dá)[16]，研究表明，DAZL在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中可作為mRNA翻譯的阻遏物和激活物發(fā)揮重要作用[17]。

版納微型豬近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)是已培育了40年的高度近交系封閉群體，是生命科學(xué)，特別是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要資源[18]。由于多年的嚴(yán)格高度近交，部分公豬出現(xiàn)了睪丸下降延遲、隱睪、單睪、生殖器官發(fā)育遲緩、畸形等問(wèn)題。基于DAZL基因在雄性哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中的獨(dú)特功能，本研究以BMI為試驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)RACE和RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增并拼接DAZL基因完整cDNA序列；利用生物信息學(xué)分析其核酸和蛋白質(zhì)序列，確定與哺乳動(dòng)物中其他物種的進(jìn)化關(guān)系；利用qPCR技術(shù)確定其mRNA在15個(gè)組織中的表達(dá)水平；將豬DAZL和EGFP融合表達(dá)，檢測(cè)其亞細(xì)胞定位；為深入挖掘DAZL基因與BMI生殖器官畸形關(guān)聯(lián)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試劑

版納微型豬近交系(BMI)(10月齡、公豬)，屠宰后采集各組織樣品。RACE等試劑盒均購(gòu)自TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 由NCBI下載DAZL基因mRNA 序列(XM_003358321.2)和(NM_001081725.1)，前者為豬的預(yù)測(cè)序列，后者為牛的測(cè)序序列，利用Oligo 7 設(shè)計(jì)引物，信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.2.2DAZL基因全長(zhǎng)cDNA克隆 RNAiso Plus提取BMI睪丸總RNA后，用RACE試劑盒反轉(zhuǎn)錄分別合成5′和3′ RACE cDNA，用常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。用LA TaqE進(jìn)行兩輪RACE-PCR擴(kuò)增，體系均為50 μL。第一輪5′RACE體系為16 μL ddH2O，25 μL 2×Gflex PCR Buffer，1 μL Tks Gflex DNA Polymerase，1 μLDAZL-GSP5′，5 μL UPM，2 μL 5′RACE cDNA；第二輪5′RACE反應(yīng)體系為21 μL ddH2O，1 μLDAZL-NGSP5′，1 μL UPS Primer，1 μL 第一輪5′RACE產(chǎn)物，Buffer、Polymerase同第一輪。第一輪3′RACE 體系為20 μL ddH2O，1 μLDAZL-GSP3′，2 μL 3′RACE Outer Primer，1 μL 3′RACE cDNA，Buffer、Polymerase同5′第一輪；第二輪3′RACE體系為20 μL ddH2O，1 μLDAZL-NGSP3′，2 μL 3′RACE Inner Primer，1 μL 第一輪3′RACE產(chǎn)物，Buffer、Polymerase同5′第一輪。PCR反應(yīng)程序均為：94 ℃ 60 s，98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，循環(huán)30次。取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 qPCR分析 以DAZL-qPCR-F/DAZL-qPCR-R為引物，進(jìn)行15個(gè)組織的qPCR定量分析，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系25 μL：2×SYBR 12.5 μL， 滅RNase的H2O 8.5 μL，50 ng·μL-1cDNA 2 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL。運(yùn)行程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s, 循環(huán)30次。采集熒光信號(hào)，結(jié)束程序。使用GraphPad Prism 8進(jìn)行顯著性分析并作圖。

1.2.4 亞細(xì)胞定位分析 以DAZL-C-F/DAZL-C-R為引物再次擴(kuò)增BMIDAZL基因，通過(guò)酶切連接法將其連接在增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)載體上；培養(yǎng)ST豬睪丸細(xì)胞系，使用Lipofectamine 2000將去除內(nèi)毒素的pEGFP-C1-DAZL質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ST細(xì)胞，并利用Mito Tracker對(duì)線粒體著色，使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并成像。

2 結(jié) 果

2.1 BMI DAZL基因cDNA全長(zhǎng)及蛋白序列

以BMI睪丸的完整cDNA、5′RACE cDNA以及3′RACE cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別獲得了接近1 000 bp(CDS)、250 bp(5′RACE)、1 000 bp(3′RACE)的條帶(圖1)，克隆測(cè)序并將序列拼接組裝，獲得了2 985 bp的cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank: KU705632)(圖2)。核酸序列分析表明，該cDNA全長(zhǎng)序列包含888 bp CDS區(qū)、184 bp 5′UTR區(qū)和1 913 bp 3′UTR區(qū)，在3′端含有連續(xù)12個(gè)A的polyA尾巴，polyA上游21 bp處有典型的5′AATAAA3′加尾信號(hào)。

BMIDAZL基因編碼295個(gè)氨基酸殘基(AOC89050)，蛋白質(zhì)分子量為33 ku；無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽，等電點(diǎn)8.9，為堿性蛋白質(zhì)；33～113位氨基酸為脊椎動(dòng)物的RRM和DAZ區(qū)(圖2)；二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量最高(59.58%)，β轉(zhuǎn)角含量最低(6.27%)，α螺旋和延伸鏈結(jié)構(gòu)含量分別為17%和17.15%。利用SWISS-MODEL 2xs7.1.A模板構(gòu)建的三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，由第26～111位氨基酸構(gòu)成。

2.2 BMI DAZL基因組結(jié)構(gòu)

利用獲得的豬DAZLcDNA全長(zhǎng)序列作為電子探針，從NCBI豬基因組Sscrofa11.1 (GCA_000003025.6)中釣取了位于豬13號(hào)染色體負(fù)鏈3 764 835～3 782 729 bp區(qū)的該基因座的基因組序列。之后利用sim4在線程序(http://doua.prabi.fr/software/sim4)分析豬DAZL基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，豬DAZL基因長(zhǎng)20 023 bp，含有11個(gè) 外顯子，ATG起始密碼子起于外顯子1末端，TGA終止密碼子止于外顯子11起始段，外顯子2～10的長(zhǎng)度和人類該基因?qū)?yīng)外顯子的長(zhǎng)度等長(zhǎng)(圖4)。

2.3 哺乳動(dòng)物DAZL氨基酸的一致性比較及進(jìn)化分析

BMI DAZL蛋白質(zhì)序列與黃牛(NP_001075194)、牦牛(ACP40088)的DAZL蛋白質(zhì)序列相似性最高，分別為95.9%和94.6%，與大鼠(XP_006244539)、小鼠(BAC28187)、人(NP_001342)、長(zhǎng)臂猿(XP_003265409)的相似性分別為92.5%、92.5%、92.5%和91.5%，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2，表明DAZL蛋白在進(jìn)化中高度保守。利用DAZL蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了7種哺乳動(dòng)物的進(jìn)化樹(shù)，偶蹄目的黃牛和牦牛聚為一類，嚙齒目的大鼠和小鼠聚為一類，二者再與BMI豬聚為一類；靈長(zhǎng)目的人和長(zhǎng)臂猿聚為一類，見(jiàn)圖5。

2.4 BMI DAZL基因組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析了10月齡BMI公豬15種組織的DAZLmRNA表達(dá)水平(圖6)，結(jié)果表明，DAZL基因在睪丸特異表達(dá)且相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他14種組織。

2.5 BMI DAZL蛋白亞細(xì)胞定位分析

為確定基因在細(xì)胞中發(fā)揮功能的具體位置，構(gòu)建EGFP與BMI豬DAZL基因的融合表達(dá)載體，PCR擴(kuò)增分別得到908和1 641 bp；雙酶切后得到902和4 700 bp，均與預(yù)期相符，表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖7。

亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，紅色熒光探針Mito Tracker靶向線粒體，從熒光的疊加圖中可以看出兩種顏色的熒光不重合，融合蛋白EGFP-DAZL主要存在于豬ST細(xì)胞的細(xì)胞核中，如圖8所示，表明DAZL蛋白主要在豬真核細(xì)胞細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) M. DL2000 ladder圖1 BMI豬DAZL基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of DAZL gene in BMI pig

3 討 論

類無(wú)精癥缺失基因DAZL在動(dòng)物雌、雄配子形成過(guò)程中起著重要調(diào)控作用，影響脊椎動(dòng)物的生殖與發(fā)育，其表達(dá)異常和功能喪失會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯，但其作用機(jī)制尚不清楚[10-12]。目前，該基因已在多個(gè)哺乳動(dòng)物物種如人[19]、小鼠[20]、牛[21]、豬[22]、羊[23]中有研究報(bào)道。BMI豬是生命科學(xué)研究的重要模式動(dòng)物，而且是人異體器官移植的重要供體，但多年的近交導(dǎo)致的部分雄性個(gè)體不育是擴(kuò)繁群體的瓶頸，為了確定BMIDAZL的全長(zhǎng)cDNA序列，以及在多組織(特別是睪丸)中的表達(dá)模式，本研究使用RACE技術(shù)克隆了BMIDAZL全長(zhǎng)2 985 bp cDNA序列(包含888 bp的CDS)；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BMI DAZL蛋白質(zhì)含有295個(gè)氨基酸，屬于堿性蛋白，分子量為33 ku；二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲比例最大，超過(guò)了50%。分子功能的約束以及分子的進(jìn)化導(dǎo)致了蛋白質(zhì)序列及其結(jié)構(gòu)的保守性，分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ谘芯炕虻墓δ芊浅Ｖ匾鞍坠δ苡蝾A(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMI DAZL蛋白含有RMP結(jié)構(gòu)域和DAZ重復(fù)結(jié)構(gòu)域。RMP結(jié)構(gòu)域也是生殖細(xì)胞特異結(jié)合RNA蛋白的區(qū)域，由DAZL的同源物編碼，是DAZ家族蛋白的祖先保守區(qū)域，它能專一性識(shí)別目標(biāo)基因mRNA 3′端GUU三聯(lián)體，調(diào)控目標(biāo)基因的翻譯；DAZ重復(fù)結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作區(qū)，參與蛋白質(zhì)分子間的相互作用。這兩個(gè)功能域是DAZL蛋白發(fā)揮功能必不可少的，可能與poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)相互作用，并在配子發(fā)生過(guò)程中充當(dāng)特定mRNA的翻譯激活劑[24]。

上圖為序列，下圖為保守結(jié)構(gòu)域，陰影部分表示RMP和DAZ結(jié)構(gòu)域，下劃線表示5′AATAAA3′加尾信號(hào) The upper picture is the sequence, the lower picture is the conserved domain, shade parts indicate RMP and DAZ domains, respectively, the underline letters indicate the 5′AATAAA3′ tail signals圖2 BMI DAZL完整cDNA序列、編碼蛋白質(zhì)序列及保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 The full-length sequences of cDNA, amino acids and conserved domains of BMI DAZL

圖3 預(yù)測(cè)的BMI DAZL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted tertiary structure of BMI DAZL protein

圖4 豬DAZL基因組結(jié)構(gòu)Fig.4 Genomic structure of pig DAZL gene

表2 哺乳動(dòng)物DAZL氨基酸序列的一致度、分歧度

圖5 哺乳動(dòng)物DAZL氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of DAZL amino acid sequence in some mammals

圖6 DAZL基因在BMI多種組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 The multi-tissues relative expression level of DAZL gene in BMI

1. 菌液PCR產(chǎn)物；2. 質(zhì)粒PCR (EGFP-F/DAZL-C-R)結(jié)果；3. 質(zhì)粒PCR (DAZL-C-F/DAZL-C-R)結(jié)果；4. pEGFP-C1-DAZL融合表達(dá)質(zhì)粒；5. XhoⅠand EcoRⅠ雙酶切結(jié)果；M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1.PCR product of bacterial liquid; 2. Product of plasmid PCR (EGFP-F/DAZL-C-R); 3. Product of plasmid PCR (DAZL-C-F/DAZL-C-R); 4. pEGFP-C1-DAZL plasmid of fusion expression; 5. The digestion product by double-enzyme XhoⅠand EcoRⅠ;M. DL2000 marker圖7 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-DAZL的鑒定Fig.7 Identification of the eukaryotic expression plasmids pEGFP-C1-DAZL

氨基酸序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BMI豬DAZL蛋白和其他6種哺乳動(dòng)物相似性均超過(guò)90%，具有高度同源性，在進(jìn)化上高度保守。DAZ基因家族基因的遺傳變異頻率非常低，BMI豬的編碼序列(KU705632)和大白豬以及中國(guó)瘦肉豬新品系DIV的序列(EU430405)完全相同[22]。Ma[25]和Zhang[22]發(fā)現(xiàn)，DAZL內(nèi)含子7和9分別有A>G和C>A兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，與大白、長(zhǎng)白、杜洛克3個(gè)商業(yè)豬種群的精子質(zhì)量性狀相關(guān)。在牛上，Sarova等[26]認(rèn)為，DAZL啟動(dòng)區(qū)CpG島的高度甲基化可能影響了荷斯坦奶牛雜交后代的生殖。在人上，Nailwal和Chauhan[13]利用NCBI公布的人DAZL基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)了7個(gè)氨基酸錯(cuò)義突變，但只有N109T可能與男性不育相關(guān)，Chen等[27]通過(guò)比對(duì)4 000多個(gè)死精、無(wú)精患者的DAZL序列發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SNPs位點(diǎn)：SNP260和SNP386，但只有SNP386可能與男性不育相關(guān)，且僅出現(xiàn)在漢族人群。DAZ家族成員BOULE僅在少數(shù)減數(shù)分裂受阻的人的內(nèi)含子中存在一些SNP[28]；在山羊中，BOULE基因僅在內(nèi)含子中存在一個(gè)g.7254T>C中度多態(tài)位點(diǎn)，且可能與產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)[29]。

A. DAZL綠色熒光蛋白；B. 線粒體Mito Tracker染色；C. 綠色熒光蛋白與線粒體的疊加 A. DAZL protein labeled by green fluorescent protein; B. Mitochondria stained by Mito Tracker; C. Overlay of green fluorescent protein with mitochondria圖8 DAZL蛋白在ST細(xì)胞中的分布Fig.8 The distribution of DAZL proteins in ST cells

DAZL不僅對(duì)雄性哺乳動(dòng)物的睪丸發(fā)育和精子發(fā)生至關(guān)重要，而且DAZL在睪丸中的分布和作用會(huì)因物種不同而不同，而且相同的物種在不同的發(fā)育階段有時(shí)也會(huì)不同[23,30-34]。比如，在驢中，DAZL 蛋白不僅存在于青春前期的睪丸細(xì)胞中，而且也存在于青春后期的原代精母細(xì)胞中[30]；在山羊中，DAZL蛋白在青春前期和后期均有表達(dá)[31]；在藏綿羊中，主要在青春后期的睪丸中表達(dá)[32]；在牛中，Liu等[34]發(fā)現(xiàn)，犏牛睪丸的DAZLmRNA表達(dá)明顯比黃牛和牦牛低；在大鼠和小鼠中，DAZL蛋白主要在成年睪丸中表達(dá)[14, 35]。本研究比較了BMI 15種組織mRNA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DAZL基因mRNA單一在BMI豬的睪丸組織中高表達(dá)，在其他組織幾乎不表達(dá)。體外熒光法檢測(cè)BMI DAZL蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)部位，結(jié)果表明，其主要在ST細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。本研究使用的是BMI 10月齡公豬，對(duì)于小型豬，一般4月齡就出現(xiàn)初情期，10月齡基本成年，也表明在成年前后高表達(dá)，與其他物種的表達(dá)趨勢(shì)基本相似。

4 結(jié) 論

本研究利用RACE技術(shù)擴(kuò)增并拼接了版納微型豬近交系(BMI)DAZL基因的完整cDNA序列(包括5′UTR、ORF、3′UTR)，從DNA角度解析了該基因的序列特征，從mRNA表達(dá)層面發(fā)現(xiàn)，該基因主要在BMI成年豬的睪丸中特異表達(dá)，從蛋白角度研究了其一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，為進(jìn)一步深入挖掘DAZL基因與BMI部分不育公豬的功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。