大蒜素對小鼠黑色素瘤B16F10細胞體外增殖和遷移能力的影響

朱芷葳，藍吳濤，馬悅悅，李鵬飛，李 宏，張 磊，司文睿，馮江浩

(1.山西農業大學生命科學學院，太谷030803；2. 山西省生物研究院有限公司，太原 030006)

黑色素瘤是一種由黑色素細胞惡變而形成的腫瘤，占所有皮膚惡性腫瘤的3%，由于其惡化速度快，轉移性強，現如今已成為人類死亡率最高的皮膚癌之一[1]。在動物中，黑色素瘤常見于家養貓、狗、豬的口腔、皮膚和足趾[2]。不論是人還是動物，傳統手術治療預后差，復發性高，并不能根治黑色素瘤，因此，亟需尋找更為簡單高效的治療方式[3]。MITF是黑色素生成過程中最關鍵的調控基因，可作為轉錄因子同啟動子區域的M-box序列結合，影響黑色素的生成[4-5]。大蒜素(allicin)是大蒜的主要成分，是大蒜中最具生物活性的含硫化合物之一。近些年，隨著流行病學的研究，人們發現大蒜素可顯著提高機體免疫系統功能，誘導生成干擾素，抑制腫瘤壞死因子的生成[6]。并且大蒜素能通過影響細胞周期、抑制原癌基因的激活、促進細胞凋亡等途徑降低癌細胞轉移和侵襲的能力[7]。本試驗研究不同濃度的大蒜素在相同處理時間下對小鼠黑色素瘤B16F10細胞中MITF基因及蛋白表達的作用，以及對B16F10細胞體外增殖和遷移能力的影響。為闡明大蒜素抑制腫瘤細胞增殖、侵襲的作用及其分子機制提供科學依據，為動物黑色素瘤的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

小鼠黑色素瘤B16F10細胞株由山西農業大學生命科學學院113號實驗室保存。DMEM購自美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗購自北京索萊寶有限公司；反轉錄試劑盒購自北京TaKaRa有限公司；MITF兔源單克隆抗體購自上海Abcam，二抗山羊抗兔IgG購自北京康為世紀有限公司；Trizol購自賽默飛世爾有限公司。

1.2 小鼠黑色素瘤B16F10細胞體外培養與處理

將B16F10細胞從液氮中取出，水浴鍋迅速復蘇，加入終止液(DMEM+10%胎牛血清)離心后用完全培養基(DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)重懸細胞，將細胞接種至培養瓶，置于5% CO2的37 ℃ 的培養箱，待細胞長滿80%～90%進行傳代。加入0.25%胰酶消化，重懸后接種至六孔板。待細胞長至指數生長期即可加入不同濃度大蒜素(0、5、10、15、20和25 μg·mL-1)進行后續試驗。

1.3 總RNA的提取與處理

將B16F10用新鮮的細胞培養基制成細胞懸液，加入Trizol混勻后冰浴靜置10 min。每個離心管加入1/5體積的氯仿混勻。冰浴靜置3 min后，離心15 min，取上清，加入等體積的異丙醇混勻，靜置10 min后,離心10 min。棄上清，加75 %乙醇洗滌后,離心10 min，將沉淀用30 μL DEPC處理水溶解，-80 ℃保存。

1.4 RNA反轉錄及qRT-PCR體系

根據TaKaRa反轉錄試劑盒與熒光定量試劑盒說明書要求，進行后續試驗。20 μL反轉錄體系將提取的RNA反轉錄成cDNA。10 μL熒光定量體系檢測基因表達量。MITF引物，F：5′-CGAAAGTTGCAACGRGAACAGCA-3′；R：5′-GAGCCTGCATT-TCAAGTTCCTGTA-3′。β-actin引物,F：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′；R：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′。

1.5 總蛋白質的提取與處理

將處理后的細胞懸浮液離心10 min。向細胞沉淀中加入添加了苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液，冰浴30 min， 離心，取上清液，并轉移到新離心管中，-80 ℃凍存。

1.6 Western blot

配制濃縮膠和分離膠，并變性蛋白用于上樣。進行80 V濃縮，120 V分離后轉膜1.5 h，脫脂牛奶封閉1 h，MITF一抗室溫作用1 h， TBST洗4次，每次5 min。加MITF二抗，搖床孵育1 h，10% TBST洗4次，每次5 min。加ECL發光液成像，以MITF和β-actin蛋白表達條帶作為AOI進行平均光密度測定。

1.7 大蒜素對B16F10細胞體外增殖能力的影響

細胞進入指數生長期后制成細胞懸液，計數后，在96孔板中每孔接種100 μL 1×105個細胞，37 ℃ 5% CO2恒溫培養箱中過夜。加入200 μL不同濃度大蒜素的培養基，使大蒜素終濃度為0、5、10、15和20 μg·mL-1。繼續培養24 h后，在各孔中加入50 μL 50%三氯乙酸(TCA)，4 ℃冰箱放置1 h。 蒸餾水洗滌5次去除TCA，晾干。每孔加入100 μL的0.4% SRB染色液進行染色，室溫靜置20 min。1%乙酸洗滌5次，除去未結合的SRB染色液。在空氣中干燥后，用DMSO溶解細胞，振蕩10 min。用全波長酶標儀在515 nm處測定各孔的吸光度值，記錄數據并計算大蒜素對細胞增殖的抑制率。

1.8 大蒜素對B16F10細胞體外遷移能力的影響

將B16F10細胞接種于24孔板上待細胞長滿80%～90%后劃痕。用無血清DMEM培養基清洗1次，將漂浮的細胞洗去。加入含有不同濃度大蒜素的無血清DMEM培養基，使24孔板內大蒜素終濃度為0、5、10、15、20 μg·mL-1，在37 ℃ 5% CO2恒溫培養箱培養42 h，此時對照組劃痕基本愈合。在倒置顯微鏡下拍照分析劃痕寬度，使用Image J軟件進行圖片處理。

1.9 統計分析

小鼠黑色素瘤B16F10增殖能力變化情況、熒光定量數據和Western blot數據使用GraphPad Prism 8.0軟件進行單因素ANOVA分析并繪圖，P<0.05被認為具有統計學意義。細胞劃痕試驗結果用Image J軟件進行分析。

2 結 果

2.1 不同濃度大蒜素處理后細胞MITF mRNA的表達量

不同濃度大蒜素處理細胞24 h后，提取細胞總RNA。熒光定量PCR檢測MITFmRNA的表達量。歸一化處理后，結果如圖1所示。對照組MITFmRNA的相對表達量最高，5、10、15、20 μg·mL-1大蒜素組MITFmRNA相對表達量均有所下降(P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001)， 呈現濃度依賴性。

**. P<0.01; ***. P<0.001圖1 不同濃度大蒜素對B16F10細胞MITF mRNA表達的影響Fig.1 The expression of MITF mRNA in B16F10 cell treated with different concentrations of allicins

2.2 不同濃度大蒜素處理后細胞MITF蛋白表達量

不同濃度的大蒜素處理細胞24 h后，提取蛋白。利用Western blot檢測MITF蛋白的表達量。結果如圖2A所示，其中，β-actin為內參蛋白。隨著試驗組大蒜素濃度的升高，MITF蛋白的表達量逐漸降低，呈劑量依賴性。圖2B是經GraphPad Prism 8.0處理后的蛋白質相對表達量柱狀圖，可以看出加入不同濃度(5、10、15、20 μg·mL-1) 大蒜素后，細胞中MITF蛋白的表達量均受到了顯著抑制(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.001)。

**. P<0.01; ***. P<0.001圖2 MITF蛋白在B16F10細胞中的表達Fig.2 The expression of MITF protein in B16F10 cells

2.3 大蒜素對B16F10細胞增殖活性的影響

B16F10細胞增殖情況如表1所示，在每個濃度都設置了9個重復。從9組數據的平均值和最終的抑制率可看出大蒜素對B16F10細胞的增殖有抑制效果，且抑制效果隨濃度升高而增強。與對照組相比，5、10、15、20 μg·mL-1大蒜素處理后B16F10細胞吸光度顯著降低(P<0.001)。結果顯示，大蒜素對小鼠黑色素瘤B16F10細胞存在抑制作用，且抑制率呈濃度依賴性增加。

表1 大蒜素對小鼠黑色素瘤B16F10細胞增殖的影響

2.4 劃痕試驗檢測B16F10細胞體外遷移能力

由Image J軟件分析得出的細胞劃痕試驗結果如圖3所示。與空白組相比，在5 μg·mL-1濃度大蒜素處理42 h后，劃痕寬度相差不顯著，說明該濃度大蒜素對B16F10細胞的遷移影響較小。在10、15、20 μg·mL-1大蒜素處理細胞42 h后，細胞劃痕愈合程度明顯受到抑制。說明10、15、20 μg·mL-1的大蒜素對B16F10細胞的遷移具有明顯的抑制作用。

3 討 論

黑色素的異常增殖是導致黑色素成瘤的原因，傳統的手術治療方式就是切除病灶。近年來，隨著黑色素瘤發病率的不斷提高，寵物和畜牧動物的健康受到了前所未有的挑戰。在我國馬[8]、牛[9]、犬[10]和豬[11]等動物都有患黑色素瘤的先例，原發于皮膚部位，也存在于各種器官黏膜處。犬的口腔下頜黏膜是黑色素瘤常發部位，發病率達到53%，且小型犬和口腔黏膜較深的犬患口腔黑色素瘤的概率更大[12]。在貓的腫瘤疾病中，最常見的原發性腫瘤就是眼部的黑色素瘤，其發病率僅次于貓乳腺腫瘤，且約60%的病例會發生轉移，導致貓的生存期和生存質量嚴重下降[13]。

MITF作為黑色素合成代謝通路上重要調控基因，起著中心樞紐的作用。MITF可以通過調控TYR基因家族間接參與黑素細胞的分化、增殖和轉移[14-15]。目前，已經發現至少有10種MITF的異構，其中，MITF-M只存在于黑色素細胞和黑色素瘤細胞中[16]。在對白化榮昌豬眼圈周圍黑素生成相關基因分析后發現與正常黑眼膛毛色豬相比，白化個體中幾乎不存在黑色小體，MITF及其下游基因TYR、TYRP1表達量顯著降低[17]。將帶有MITF-M的真核表達載體轉染進綿羊細胞后，TYRP1表達量升高至5.06倍，黑色素生成顯著增加[18]。MITF的表達影響黑色素生成的同時，也可能導致黑色素細胞的癌變。已有的研究表明，MITF的表達含量能影響黑色素細胞的惡性轉化及黑色素瘤的發生，且在黑色素瘤患者中，MITF處于失調的狀態[19]。Rheostat動態模型把MITF作為一個動態的變阻器，高水平的MITF使得細胞具有更多的增殖表型，低水平的MITF則導致細胞增殖活性降低，具有更高的侵襲表型并具有腫瘤細胞起始特征，更低水平的MITF將導致細胞死亡[20]。因此，MITF表達的穩定是維持黑色素正常形成的關鍵，也是細胞維持正常狀態的重要一環。

A～E分別代表0、5、10、15、20 μg·mL-1大蒜素處理組；a. 0 h劃痕圖；b. ImageJ可視化的0 h劃痕圖；c. 42 h劃痕圖；d. ImageJ可視化的42 h劃痕圖 A-E represented 0, 5, 10, 15, and 20 μg·mL-1 allicin treatment groups, respectively；a. 0 h after wound healing assay；b. Visualized 0 h diagram in ImageJ；c.0 h after wound healing assay；d. Visualized 42 h diagram in ImageJ圖3 細胞劃痕結果Fig.3 The results of wound healing

大蒜素作為大蒜提取物，對于多種細菌都有殺滅的效果。以往對大蒜素的研究主要集中于其抗病毒、抗細菌以及抗真菌的功能[21-23]。近年來，隨著研究的不斷深入，發現大蒜素不僅有抑菌功能，并且對于多種腫瘤，如肝癌、胃癌、婦科惡性腫瘤等多種腫瘤的發展都有抑制效果[24-25]。在B16F10細胞中，大蒜提取液可通過下調Akt、Bcl-2基因和上調PTEN、Bax的表達來抑制增殖并促進細胞凋亡[26]。最近的研究表明，大蒜素可以參與并激活Wnt/β-catenin信號通路，有效抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和轉移[27]。另外，在胃癌SGC-7901細胞中，大蒜素會導致細胞內質網的凋亡，從而抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖能力[28]。總之，大蒜素對于腫瘤的抑制作用體現在影響基因表達、改變細胞信號通路和阻礙細胞周期等方面[29]。

本試驗設置不同大蒜素濃度的試驗組，采用qRT-PCR和Western blot檢測MITFmRNA和蛋白的表達水平；并通過SRB染色法和細胞劃痕試驗研究了大蒜素在體外對于小鼠黑色素瘤B16F10細胞的增殖和遷移的影響。結果顯示，隨著試驗組大蒜素濃度的升高，細胞中MITFmRNA的表達量逐漸降低，呈濃度依賴性；Western blot結果與qRT-PCR呈一致趨勢，隨著大蒜素濃度的升高，MITF蛋白的表達量逐漸降低。大蒜素在5、10、15、20 μg·mL-1濃度時對B16F10細胞增殖能力有顯著抑制效果(P<0.001)，且隨著濃度的升高抑制能力逐漸增強。當大蒜素為20 μg·mL-1時，大蒜素對B16F10細胞的抑制率達到了44.22%。劃痕試驗結果顯示，大蒜素對B16F10細胞的體外遷移有抑制作用。當大蒜素濃度在10、15、20 μg·mL-1時劃痕愈合程度較低，對細胞遷移力抑制較大。

4 結 論

0～20 μg·mL-1大蒜素對黑色素瘤B16F10細胞的增殖、遷移都具有一定的抑制效果，且對小鼠黑色素瘤B16F10細胞MITF的表達有顯著的抑制效果，為進一步研究動物黑色素瘤的發生發展及其治療提供了一定的理論基礎。