磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B與基質(zhì)金屬蛋白酶9在鉑耐藥上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義△

劉坤，楊勇，付鳳蓮，王羽豐，楊梅，魯鳳麗

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院1干療科，2泌尿科，昆明 650118

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，僅次于宮頸癌和宮體癌，但病死率卻居婦科腫瘤的首位。2018年全球有295 000例新病例和184 000例死亡病例。由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，難以早期發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)卵巢癌就診時已為晚期，缺乏有效的根治方法，含鉑方案化療是主要的治療手段，但易復(fù)發(fā)，5年生存率不足30%，患者一旦發(fā)生鉑耐藥，腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲速度加快，死亡風(fēng)險增加。鉑類藥物化療耐藥是治療卵巢癌的主要障礙，嚴(yán)重影響卵巢癌患者的治療效果及預(yù)后。因此，探討鉑耐藥發(fā)生的潛在機(jī)制，研究卵巢癌耐藥評估的方法對于提高卵巢癌的治愈率有重要的意義。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）家族是生長因子超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要分子，可被多種細(xì)胞因子和理化因素激活，激活的PI3K促使蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）蛋白活化。活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能（包括代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成）。AKT主要負(fù)責(zé)由PI3K始動的生物信息的轉(zhuǎn)導(dǎo)，處于PI3K/AKT信號通路的中心環(huán)節(jié)，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控以及生長凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。正因?yàn)镻I3K/AKT通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療等方面都有著巨大潛力，其近年來也成為生物科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。有研究表明PI3K/AKT通路通過多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生；也有研究表明PI3K/AKT信號通路的激活有可能與人上皮性卵巢癌鉑耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究通過檢測上皮性卵巢癌鉑類敏感與鉑類耐藥患者血清中PI3K/AKT和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的水平，進(jìn)一步分析其在耐藥組內(nèi)不同臨床特征患者血清中的表達(dá)差異，探討PI3K、AKT及MMP9的表達(dá)與鉑耐藥上皮性卵巢癌的關(guān)系和相關(guān)機(jī)制，為臨床早期判斷卵巢癌耐藥提供相關(guān)的參考指標(biāo)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年9月至2018年9月在云南省腫瘤醫(yī)院就診的上皮性卵巢癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為晚期卵巢癌；生存期≥3個月；腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后病理學(xué)檢查確診為上皮性卵巢癌；術(shù)后均采用以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：有化療禁忌證或不愿意接受化療；合并嚴(yán)重感染、嚴(yán)重精神障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。唤邮苓^PI3K抑制劑等臨床試驗(yàn)。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入78例上皮性卵巢癌患者，按照2018年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）卵巢癌指南定義分為卵巢癌鉑耐藥組（n=40）和鉑敏感組（n=38），其中鉑敏感組定義為初期采用以鉑類為基礎(chǔ)的化療獲臨床緩解（臨床癥狀消失，盆腔檢查和B超檢查均無包塊，血清糖類抗原125值下降至正常），停藥超過6個月未出現(xiàn)復(fù)發(fā)；鉑耐藥組定義為初期采用以鉑類為基礎(chǔ)的化療達(dá)到臨床緩解，但完成化療后，在相對較短的時間內(nèi)（即6個月之內(nèi)）出現(xiàn)復(fù)發(fā)。鉑耐藥組中，年齡38～72歲，平均（51.70±7.18）歲；鉑敏感組中，年齡32～79歲，平均（52.67±9.23）歲；兩組患者年齡、臨床分期、病理類型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 鉑敏感組與鉑耐藥組患者的臨床特征[n（%）]*

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者采用以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療6～8個療程，直至疾病進(jìn)展。

1.2.2 血清采集 清晨空腹采集治療前患者的外周靜脈血6 ml，靜置0.5～1.0 h，在5000 r/min離心機(jī)下離心15 min，分離新鮮血清，取上清液，分裝于-20℃冰箱保存，分批待檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟分別進(jìn)行PI3K、AKT及MMP9的檢測。每2個周期化療結(jié)束后兩周，通過CT等檢查評價療效。

1.2.3 療效評價標(biāo)準(zhǔn) 所有入選患者均接受含鉑方案化療，治療前后進(jìn)行全面檢查以評價治療效果。采用實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）進(jìn)行療效評價。分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）。CR：所有目標(biāo)病灶消失；PR：基線病灶長徑總和縮小≥30%；PD：基線病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；SD：基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)到PR，或有增加但未達(dá)PD。CR、PR、SD均視為治療有效，PD則視為治療無效。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PI3K、AKT與MMP9表達(dá)水平的比較

鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT、MMP9水平均高于鉑敏感組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.78、2.16、2.23，P＜0.05）。（表2）

表2 兩組患者血清PI3K、AKT與MMP9水平（±s）

2.2 不同臨床特征鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT和MMP9水平的比較

不同臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤的鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；組織學(xué)分級為G級、病理類型為透明細(xì)胞癌的鉑耐藥組患者血清PI3K及AKT水平分別高于組織學(xué)分級為G級及其他病理類型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有脈管浸潤的鉑耐藥組患者血清MMP9水平分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及無脈管浸潤患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同組織學(xué)分級、病理類型的鉑耐藥組患者血清MMP9水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征的鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT和MMP9水平（n=40）

2.3 血清PI3K、AKT、MMP9在鉑耐藥上皮性卵巢癌中的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，40例鉑耐藥上皮性卵巢癌患者外周血清中，PI3K與AKT表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.472，P＜0.05），PI3K與MMP9表達(dá)無相關(guān)性（r=0.187，P＞0.05），AKT與MMP9表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.431，P＜0.05）。

3 討論

鉑耐藥一直是嚴(yán)重影響卵巢癌患者治療效果和預(yù)后的幕后黑手。既可以是原發(fā)性鉑耐藥，也可能是繼發(fā)性鉑耐藥，如果能發(fā)現(xiàn)潛在標(biāo)志物可早期預(yù)測、分析鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制，可能會提高卵巢癌患者的治療有效率，延長患者總生存期。近幾年，卵巢癌鉑耐藥的探索一直是研究的熱點(diǎn)，從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常，從相關(guān)染色體變化、DNA修復(fù)基因改變、凋亡蛋白抑制因子的出現(xiàn)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶解毒作用增加，以及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和黏附能力的改變，從而引起細(xì)胞骨架重排、蛋白激活表達(dá)等均可能成為鉑耐藥的發(fā)病機(jī)制。

順鉑是治療上皮性卵巢癌的常用藥物，無論在輔助治療還是姑息治療階段，其細(xì)胞毒作用主要通過形成鉑-DNA絡(luò)合物，破壞DNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA損傷，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制中起到了非常明顯的作用。鉑-DNA絡(luò)合物引發(fā)細(xì)胞中DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞中相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活或者被抑制時，細(xì)胞的凋亡程序受到抑制，進(jìn)而表現(xiàn)出對鉑類化療藥物無反應(yīng)，發(fā)生鉑耐藥或鉑抵抗。

PI3K/AKT作為細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與很多重要的生物學(xué)過程的調(diào)控，其通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用，并且此通路在腫瘤對放療的抵抗、腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與增殖以及侵襲與轉(zhuǎn)移中關(guān)系密切。

MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員，能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分及基底膜中的Ⅳ型膠原纖維，破壞阻止腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的組織學(xué)屏障，從而引起細(xì)胞骨架重排、蛋白激活表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及鉑耐藥中起決定性作用。

有研究認(rèn)為，鉑耐藥的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。順鉑可以通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活凋亡信號引起DNA損傷，當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制時，細(xì)胞凋亡被抑制，表現(xiàn)出鉑耐藥或鉑抵抗。還有研究表明，順鉑能夠在多種腫瘤細(xì)胞中激活PI3K/AKT信號通路，使AKT下游蛋白磷酸化，PI3K抑制劑可以阻斷這些現(xiàn)象，提高細(xì)胞對順鉑的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌鉑耐藥組患者血清PI3K、AKT水平均高于鉑敏感組，進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/AKT信號通路在上皮性卵巢癌鉑耐藥中的作用。卵巢透明細(xì)胞癌是卵巢癌中惡性度較高的，也經(jīng)常出現(xiàn)鉑類藥物耐藥性的產(chǎn)生，且卵巢透明細(xì)胞癌中存在高頻率的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunitalpha，PIK3CA）突變，運(yùn)用PIK3CA基因靶向藥物可能會對耐藥透明細(xì)胞癌的治療提供新的治療方案。本研究也發(fā)現(xiàn)，在鉑耐藥組上皮性卵巢癌患者中，不同病理類型患者的PI3K及AKT水平不一樣，其中透明細(xì)胞癌患者血清中PI3K及AKT水平高于其他病理類型的卵巢癌；組織學(xué)分級為G級的患者血清PI3K及AKT表達(dá)水平高于G級患者；研究還發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌鉑耐藥組患者血清MMP9水平高于鉑敏感組，表達(dá)水平在臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有脈管浸潤患者中升高。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，40例鉑耐藥上皮性卵巢癌患者外周血清中，PI3K與AKT表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.472，P＜0.05），AKT與MMP9表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.431，P＜0.05）。結(jié)果表明，PI3K/AKT信號通路在上皮性卵巢癌鉑耐藥中起著重要作用，活化的AKT通過激活下游靶蛋白如MMP9等抑制細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

綜上所述，PI3K、AKT及MMP9在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者血清中高表達(dá)，且PI3K及AKT的表達(dá)水平與組織學(xué)分級和病理類型有關(guān)，MMP9表達(dá)水平與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤有關(guān)；MMP9表達(dá)與AKT表達(dá)呈正相關(guān)。這些結(jié)果在臨床實(shí)踐中有著潛在的應(yīng)用價值，外周血PI3K、AKT及MMP9高表達(dá)是否可以作為評估鉑耐藥的參考指標(biāo)以及化療前外周血PI3K、AKT及MMP9高表達(dá)的患者使用非鉑類化療或PI3K抑制劑是否療效更好需要未來的研究去探索，為鉑耐藥卵巢癌患者探索有效的延緩和逆轉(zhuǎn)耐藥的新策略提供一定的依據(jù)。