膠質瘤相關腫瘤基因同源3在惡性腫瘤中的研究進展△

張良強，王志剛，段睿#

1湖北民族大學附屬荊門市第一人民醫院肝膽胰外科，湖北 荊門 448000

2湖北民族大學醫學部荊門臨床醫學院，湖北 荊門 448000

膠質瘤相關腫瘤基因（glioma associated oncogene，GLI）最初在 1987 年由 Kinzler等在人大腦膠質瘤中被檢測出，因此而得名。1988年，Ruppert等鑒定出GLI家族包含3名成員[膠質瘤相關腫瘤基因同源1（glioma associated oncogene homologue 1，GLI1）、GLI2和GLI3]，均為含有CH型高度保守的鋅指結構，能特異性識別并結合5'-GACCACCCA-3'DNA系列調控靶基因的轉錄，在人類發育、組織特異性分化及腫瘤中扮演著重要作用。GLI3定位于人7號染色體（7p13），該基因包含14個外顯子，基因大小為8.5 kb，編碼由1596個氨基酸構成的分子量約為190 kD的蛋白，在除了腎臟和腦組織以外的幾乎所有正常組織中廣泛表達。GLI3除了含有N-末端的轉錄抑制域和CH鋅指結構域、C-末端的活性轉錄結構域等主要功能域外，中間還含有能調節核內轉錄的環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cyclic AMP-response element binding protein，CREB）、E3-泛素化連接酶的MID1（E3 ubiquitin ligase，MID1）、蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）及復合抑制物（supressor of fused，SUFU）等多種結合位點區域。已證實，GLI3的C-末端截短突變會導致肢端發育畸形。研究表明，GLI3在磷酸化、泛素化及甲基化的調控下能發揮相應的生理調控作用。其中，在接受蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）-酪蛋白激酶 1（casein kinase 1，CK1）的磷酸化或 Cu1/β-TrCP和Cu3/SPOP的E3-泛素化途徑的調控下可發生C-末端截短轉為分子量為83 kD的抑制刺猬（hedgehog，Hh）通路靶基因轉錄的GLI3阻遏形式（GLI3-repressor，GLI3R），不僅參與調節人T淋巴細胞和胎兒肝B淋巴細胞的發育成熟介導人體免疫應答，而且在Hh通路中通過調控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路與促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）-胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）通路促使人臍靜脈內皮細胞中的白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、人趨化因子1（fractalkine 1，CXC-1）、人趨化因子2（fractalkine 2，CXC-2）及血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等造血因子表達上調促進血管生成，也能激活人類多功能干細胞產生大量的造血祖細胞促進造血。Fu等還發現，在K436和K595處甲基化能分別增強保持全長形式的 GLI3（GLI3 full-length，GLI3FL）的穩定性和與DNA結合的能力，增強Hh通路活化作用，在惡性腫瘤的生長和轉移中發揮明顯致瘤作用。近年來，GLI3在多種惡性腫瘤中的作用備受關注，有望成為潛在靶點。本文結合文獻就GLI3在惡性腫瘤中的相關研究進展作一綜述。

1 GLI3與Hh 信號通路的關系

據報道，大約有25%源自內胚層的人類致命性腫瘤存在著Hh通路的異常活化。Hh信號通路激活是通過調控下游靶基因轉錄效應分子控制上皮細胞及間質細胞的相互作用，調控著腫瘤細胞增殖和分化行為。然而，Hh通路激活主要受制于負向調控元件的十二次跨膜蛋白Patched（Patch）和正向調控元件的七次跨膜蛋白Smothened（SMO）兩種膜蛋白受體，且存在兩種效應途徑，其中，缺乏Hh配體（Indian Hh、Desert Hh、Sonic Hh）時，負向調控的十二次跨膜蛋白Patch與正向調控的七次跨膜蛋白SMO結合能抑制SMO的活化，此時負向調控元件的復合物SUFU與GLI2/3進行結合，通過磷酸化途徑將其水解為主要的GLI3R，并使未入細胞核的GLI1完全降解，抑制下游靶基因轉錄；當存在Hh配體時，Hh配體與Patch受體結合后，Patch抑制SMO被解除，從而釋放SMO，SUFU主要與GLI3R發生分離，進而使GLI3能保持全長，導致GLI1、GLI3FL共同進入細胞核，啟動調節靶基因轉錄，調控細胞周期、細胞凋亡、遷移及腫瘤的惡性行為。在此過程中，GLI3表現出復雜的功能作用，即Hh通路異常激活的關鍵是存在GLI1和GLI3FL同時易位進入細胞核內，GLI3FL維持著GLI1轉錄活性的關鍵，且失去GLI3R后也是激活該通路的關鍵一步。

2 GLI3與惡性腫瘤的關系

2.1 GLI3與肺癌

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤，其病死率也位居惡性腫瘤第一位，嚴重危害著全球人類的健康。Iwasaki等通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測102例Ⅱ～Ⅳ期肺腺癌組織標本中GLI1、GLI2、GLI3 mRNA的表達水平發現，高表達的GLI1或GLI3與Ⅱ～Ⅳ肺癌的不良預后相關，不同GLI1 mRNA（低表達vs高表達為 41.7% vs 20.0%，P=0.0074）、GLI3 mRNA（低表達vs高表達為43.1% vs 13.3%，P=0.0062）表達情況患者的5年生存期有差異，可見異常激活Hh通路存在著GLI1和GLI3促進肺癌進展。在機制方面，由Fu等實驗發現，GLI3甲基化能增加GLI3的穩定性和與DNA結合能力，導致Hh信號過度激活（GLI1表達水平過度上調），且GLI3甲基化也有助于動物體內腫瘤及體外的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞的生長和轉移。Liu等研究表明，在NSCLC細胞中miRNA-520B能靶向抑制GLI2和GLI3表達，通過抑制SPOP使兩者的3'-UTR泛素化受到抑制，從而維持著GLI2和GLI3全長穩定，使Hh通路過度激活（主要表現為GLI1蛋白表達上調）和Bcl-2蛋白高表達，促進NSCLC細胞的增殖和轉移。

2.2 GLI3與結直腸癌

結直腸癌發病率居全球惡性腫瘤第三位，病死率居第四位。Kang等研究表明，敲低GLI3表達的結腸癌細胞（RKO和LOVO）會出現腫瘤細胞生長受到抑制，細胞生長周期也停滯在G～M期，限制了腫瘤細胞的增殖行為，并能對5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、奧沙利鉑（oxaliplation，LOHP）和伊立替康（irinotecan，CPT-11）化療藥物產生耐受，同時發現其伴隨著抑癌因子p53的表達上調。Trnski等研究發現，GLI3和GSK3β在人結腸癌組織中高表達；在結腸癌細胞中使用氯化鋰干擾GSK3β，能增強GLI3-SUFU-GSK3β復合物的形成，促進GLI3發生裂解和抑制Hh通路激活（GLI1表達水平過度下調），此時，結腸癌細胞增殖行為降低并能誘導腫瘤細胞凋亡。可見，GLI3是一種結腸癌致癌因子，Hh通路的過度激活有賴于GLI3FL形成而發生致瘤，GSK3β通過微調GLI3保持GLI3FL狀態發揮促瘤作用，此點可能為將來GLI3的惡性生物學行為、耐藥及靶向治療提供思路。

2.3 GLI3與肝癌

肝癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，肝癌的發生與肝硬化進展有關。研究發現，在肝癌組織中GLI3的表達水平上調，其中miRNA-378a-3p表達與GLI3的表達呈負相關；同時在肝硬化動物模型中證明GLI3是一種重要的促肝纖維化因子，且miRNA-378a-3p能靶向GLI3表達抑制肝纖維化進展。虞玲華等研究也發現，GLI1與GLI3在肝細胞肝癌組織中較癌旁組織表達上調，GLI1與GLI3的表達呈正相關（r=0.432，P＜0.05），其中GLI1多提示不良預后，而GLI3也多集中在低分化的肝細胞肝癌中，兩者很可能提示肝細胞肝癌的惡性行為。Zhang等研究發現，在肝癌組織中，腫瘤干細胞指示因子CD90陽性表達的肝癌中多伴有GLI1和GLI3表達上調，三者表達上調均與肝癌患者較短的生存期有關（P＜0.05）；敲低GLI1和GLI3的肝癌細胞能抑制伴有CD90陽性的肝癌干細胞株的遷移和球體形成能力，而在多組肝癌細胞株中發現，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號轉導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）水平伴隨著下降；進行IL-6治療反向證實，IL-6能部分逆轉由GLI1和GLI3敲除引起的細胞增殖、球體形成能力和遷移能力的抑制。由此可見，GLI3參與肝癌的發生及進展，通過促進Hh通路異常激活及介導IL-6-JAK2-STAT3通路影響肝癌及肝癌干細胞的惡性行為。

2.4 GLI3與胰腺癌

胰腺癌是一種預后極差的惡性腫瘤，病死率居全球惡性腫瘤第七位。基于此，尋找胰腺癌的診斷和預后指標顯得尤其重要。Ma等研究通過PCR檢測結果顯示，99例胰腺癌組織中GLI3 mRNA表達高于癌旁組織，其高表達與血管侵犯、遠處轉移及分化程度低有相關性；并且在胰腺癌細胞中GLI3與抑癌基因miRNA-494在胰腺癌細胞（PANC-1）中的表達也呈負相關；轉染miRNA-494后胰腺癌細胞的活力和遷移能力降低，而轉染GLI3后能恢復腫瘤細胞的活力和遷移行為，證實了GLI3促進腫瘤的作用，抑癌基因miRNA-494為其靶分子。此研究表明，GLI3可能成為胰腺癌一種預后及檢測指標，而抑癌基因miRNA-494為抑制GLI3的靶基因，將為預后評估及治療方面提供新的思路，但需要多中心研究支持。

2.5 GLI3與胃癌

Kageyama-Yahara等指出，人黏蛋白5AC（mucoprotein 5AC，MUC5AC）表達上調與胃黏膜腸化生相關，其研究發現GLI家族蛋白能調控MUC5AC的表達，而上調GLI1、GLI2、GLI3均能促使胃癌細胞MUC5AC表達量上升。Wang等發現，在280例胃腺癌組織中，GLI3陽性表達與脂質代謝分子的人酰基輔酶A硫酯酶1（acyl-coathioesterase 1，ACOT1）存在正相關；生存分析發現，胃腺癌組織中GLI3或ACOT1陽性的患者生存時間均較短，二者同時陽性表達患者的生存期更短，生存曲線面積更小，提示預后更差。同時，Wang的團隊通過全基因圖譜測序及分子譜分析發現，GLI3是胃癌的一種新的驅動基因。

2.6 GLI3與前列腺癌

Bragina等研究了Hh通路信號分子在人前列腺癌轉基因小鼠模型中的作用，發現信號組件中僅音猬因子（snoic hedgehog，Shh）、GLI1和GLI3蛋白在人前列腺癌小鼠模型組織中高表達，并能促進前列腺癌的生長，而GLI2與之相反。機制方面，Li等研究發現前列腺癌細胞中存在一種Hh信號通路的非經典活化途徑是GLI3與轉錄活性雄激素受體（androgen receptor，AR）結合產生相互作用，導致前列腺癌細胞的生長；其進一步在細胞轉染AR的前列腺癌細胞中發現，GLI3FL/GLI3R比例明顯升高，去除AR后腫瘤細胞中的GLI3FL/GLI3R比例反而下調。這一結果表明，前列腺癌中GLI3FL和AR表達水平呈正相關，GLI3FL和AR可能協同影響著前列腺癌的發生及進展，其具體機制有待進一步研究闡述。

2.7 GLI3與口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）

Rodrigues等研究發現，GLI3在OSCC組織和OSCC細胞系中均表達上調，而陽性表達也多集中在T/T期的侵襲性OSCC，并且GLI3高表達也多集中在生存期短的患者組織中。利用PCR陣列分析，比較GLI3在腫瘤干細胞指示因子CD44高和CD44低的OSCC細胞株（SCC4和SCC9）中的表達情況發現，CD44高的OSCC腫瘤干細胞中GLI3的表達量增加了6倍以上，提示著GLI3可能通過調控上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）導致腫瘤干細胞的活化，極有可能成為潛在導致腫瘤干細胞的一種靶基因。這一結論預示著，GLI3參與調控EMT促進腫瘤干細胞形成，發揮著促進OSCC的作用，為治療提供了新的思路和潛在的治療靶點。

2.8 GLI3與其他惡性腫瘤

Natsumeda等研究發現，在人類髓母細胞瘤組織中GLI1和GLI3均高表達，二者表達均提示腫瘤分化程度低；其中，GLI3不僅在Hh異常激活的髓母細胞瘤中高表達，也在WNT信號激活的髓母細胞瘤中呈擴散式表達，而GLI1在WNT激活的髓母細胞瘤中表達受到抑制。這一研究提示著GLI3可能通過介導著Hh通路和WNT通路發揮惡性生物學行為作用，但需要進一步研究加以證實。Kurita等發現，GLI3能結合凋亡受體4（death receptor 4，DR4）抑制膽管癌細胞凋亡，利用siRNA干擾GLI3表達能恢復膽管癌細胞中的DR4與腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的結合誘導凋亡，而敲除GLI1和GLI2未發現此作用。Dai等研究指出，miRNA-140-5p是GLI3的直接靶基因；在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）細胞及其親代細胞研究中發現，miRNA-140-5p上調能抑制GLI3的表達，且長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因 7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）的表達下調和miRNA-140-5p表達上調，能影響NPC細胞的集落形成行為、惡性增殖、誘導凋亡及抑制GLI3的表達，其機制可能為下調的SNHG7通過上調miRNA-140-5p抑制GLI3的表達，進一步抑制NPC細胞的增殖并促進其凋亡。在頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細胞系研究中，GLI抑制劑（GANT61）和氯化鋰（lithium chloride，LiCl）能降低HNSCC細胞的增殖能力和集落形成行為；其中，使用LiCl處理后，增強抑制GSK3β蛋白Ser9的磷酸化，使GLI3從全長形式到阻遏形式轉化，從而抑制了HH-GLI通路活化。此點，為其臨床應用提供一定線索。Bolze等關于絨毛膜癌的發生和免疫耐受性相關的760個基因組表達情況的研究中，在使用單一化療藥物（甲氨蝶呤或放線菌素D）治療耐藥性絨毛膜癌（n=34）與化療敏感性絨毛膜癌（n=9）相比，其中僅有4個癌基因表達顯著降低，其中就包括GLI3。此研究表明，GLI3是一種耐受化療藥物的致癌基因。但在另一項關于急性髓細胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）的研究結果表明，GLI3下調是誘導AML耐藥的潛在機制。為何會存在這種與多數惡性腫瘤相反的結果差異有待進一步研究探討。

3 小結與展望

綜上所述，GLI3在惡性腫瘤中多表現為一種致癌因子，與多數惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、侵襲及耐受化療藥物等相關，通過siRNA技術干擾GLI3表達能夠影響腫瘤惡性生物學行為，可為惡性腫瘤的診斷、靶向藥物治療及療效評價提供新的思路。目前GLI3研究多處于基礎實驗階段，其致癌機制是可能通過與自身甲基化，泛素化作用，或與GLI1、黏蛋白MUC5AC及脂質代謝調節因子ACOT1等因子協同作用，或參與EMT、腫瘤干細胞形成，或通過介導Hh通路、IL-6/JAK2/STAT3通路、WNT信號通路等相關。然而，GLI3是否也通過以GLI3FL入細胞核啟動靶基因轉錄致Hh通路過度活化發揮致癌，或是否存在Hh通路的其他信號分子共同調控惡性腫瘤發生發展，以及GLI3R是否也能促進腫瘤血管生成發揮促癌作用有待證實，且目前缺乏關于GLI3進行臨床診斷和治療的相關臨床研究，以及其在AML中顯示抑癌效應，需要進一步探究。鑒于GLI3的直接靶基因多為非編碼 RNA（miRNA-520b、miRNA-494、miRNA-140-5p等），這些靶基因可能在未來抗癌藥物的設計中提供思路。相信隨著新的實驗技術的不斷應用、多個相關學科的綜合發展及臨床應用研究進一步探究，對GLI3的認識會越來越完整、準確，有望成為一種新的惡性腫瘤生物學靶分子。