細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白5在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義△

李德新，李飛，趙曉晨，李華，李茂德，蘭戴天，安祥

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院（東院）肝膽胰腺外科，成都 610010

肝細(xì)胞肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病情嚴(yán)重、發(fā)展迅速，病死率極高。早期肝細(xì)胞肝癌患者往往缺乏特異性的臨床癥狀，就診時(shí)已處于中晚期，臨床預(yù)后較差。目前，早期肝細(xì)胞肝癌患者主要采取根治性手術(shù)治療，中晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性干細(xì)胞肝癌患者主要采用全身治療（如靶向治療）+局部治療（手術(shù)、消融、放療、經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞化療等），但治療效果并不理想。探討肝細(xì)胞癌的形成機(jī)制，尋找關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)，對肝細(xì)胞肝癌的治療有重要意義。細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白 5（cell division cycle associated 5，CDCA5）基因?qū)儆诟伟?shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）熱點(diǎn)區(qū)域基因，其相對表達(dá)量及在細(xì)胞的定位隨細(xì)胞周期不同而變化，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖分化。研究顯示，CDCA5在多種腫瘤組織中高表達(dá)，可以與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）共同作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、細(xì)胞周期蛋白 B1（cyclin B1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白，其復(fù)合物有絲分裂促進(jìn)因子在細(xì)胞周期G/M期中發(fā)揮重要作用，不同的CDK-周期蛋白質(zhì)復(fù)合物可促進(jìn)特異性的靶蛋白質(zhì)磷酸化而激發(fā)細(xì)胞周期各期的順利進(jìn)行，CDK通過調(diào)節(jié)靶蛋白磷酸化而調(diào)控細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)。因此，本研究通過檢測CDCA5和ERK在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)，分析其作用機(jī)制，旨在明確CDCA5在肝細(xì)胞肝癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年1月四川省人民醫(yī)院肝膽外科收治的原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)病理學(xué)檢查確診為肝細(xì)胞肝癌；術(shù)前均未接受過放化療治療；臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并轉(zhuǎn)移性肝癌或其他惡性腫瘤；合并急性嚴(yán)重感染、明顯肝腎功能不全；合并血液系統(tǒng)疾病或自身免疫系統(tǒng)疾病；無法耐受手術(shù)治療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入260例肝細(xì)胞肝癌患者，其中男174例，女86例；年齡25～75歲，平均（51.34±11.25）歲；腫瘤直徑≤5 cm 121例，＞5 cm 139例；Edmondson分級：Ⅰ級41例，Ⅱ級83例，Ⅲ級72例，Ⅳ級64例；巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期：0期47例，A期80例，B期77例，C期56例；合并門靜脈癌栓118例，未合并門靜脈癌栓142例；甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平：≥400 ng/ml 164例，＜400 ng/ml 96例。同期選取52例肝臟良性病變患者作為對照，其中男35例，女17例；年齡26～75歲，平均（51.62±11.18）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。取肝細(xì)胞肝癌患者的肝癌組織和肝臟良性病變患者的正常肝組織。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription- polymerase chain reaction，RTPCR）測定CDCA5、ERK mRNA的相對表達(dá)量

取肝細(xì)胞肝癌患者的肝癌組織和肝臟良性病變患者的正常肝組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測定CDCA5、ERK mRNA在肝細(xì)胞肝癌組織中的相對表達(dá)量，勻漿后，Trizol法提取組織總RNA，總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測CDCA5、ERK、CDK1、cyclin B1蛋白的相對表達(dá)量

無菌取肝細(xì)胞肝癌組織或正常肝組織約50 mg，研磨提取總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將提取的總蛋白（50 μg）樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶封閉后，加入CDCA5、ERK、CDK1、cyclin B1抗體，4 ℃孵育過夜后加入二抗，37℃孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測，以β-actin為內(nèi)參，采用Photoshop圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CDCA5、ERK mRNA相對表達(dá)量的比較

肝細(xì)胞肝癌組織中CDCA5、ERK mRNA的相對表達(dá)量分別為（0.81±0.10）、（0.92±0.07），均高于正常肝組織的（0.63±0.03）、（0.54±0.11），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.210、3.652，P＜0.05）。

2.2 CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白相對表達(dá)量的比較

肝細(xì)胞肝癌組織中CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白的相對表達(dá)量均高于正常肝組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

2.3 不同臨床特征肝細(xì)胞肝癌患者肝細(xì)胞肝癌組織中CDCA5和ERK mRNA相對表達(dá)量的比較

不同年齡、性別肝細(xì)胞肝癌患者肝細(xì)胞肝癌組織中CDCA5、ERK mRNA的相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同腫瘤直徑、Edmondson分級、BCLC分期、合并門靜脈癌栓情況和AFP水平肝細(xì)胞肝癌患者肝細(xì)胞肝癌組織中CDCA5、ERK mRNA的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征肝細(xì)胞肝癌患者肝細(xì)胞肝癌組織中CDCA5和ERK mRNA的相對表達(dá)量（n=260）

2.4 CDCA5和ERK的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床特征的相關(guān)性

CDCA5、ERK的表達(dá)與Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、BCLC分期為B～C期、有門靜脈癌栓和AFP水平升高呈正相關(guān)（P＜0.05）。（表3）

表3 CDCA5和ERK的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床特征的相關(guān)性

3 討論

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床主要采取手術(shù)治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，CDCA5和ERK在肝細(xì)胞肝癌組織中的相對表達(dá)量較高，表明CDCA5和ERK的異常高表達(dá)可能與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病有關(guān)。ERK包括ERK1和ERK2，磷酸化的ERK1/ERK2可以將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞癌變等多種生物學(xué)行為。CDCA5可以通過促進(jìn)姐妹染色單體在細(xì)胞周期S期和G/M期穩(wěn)定結(jié)合介導(dǎo)DNA的重組修復(fù)，還可以保證姐妹染色單體在有絲分裂后期準(zhǔn)確分離，參與了細(xì)胞分裂、增殖及凋亡的整個過程。Tokuzen等的研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5包含ERK和CDK1/cyclin B1的磷酸化位點(diǎn)，其中ERK2磷酸化CDCA的5位點(diǎn)為S79和S209，CDK1/cyclin B1磷酸化CDCA5的位點(diǎn)為S21、S75 和 T159。陳墅圳等研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5可能依賴ERK的磷酸化來發(fā)揮促癌作用，ERK在傳導(dǎo)細(xì)胞外信號的過程中，進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化CDCA5通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程。Shen等的研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5在肝癌組織中高表達(dá)，且CDCA5基因沉默會抑制CDK1和cyclin B1的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞肝癌組織中CDK1、cyclin B1的相對表達(dá)量均明顯上調(diào)，與上述研究一致，CDK1和cyclin B1是細(xì)胞周期的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，其復(fù)合物有絲分裂促進(jìn)因子在細(xì)胞周期向G/M期進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，表明CDCA5可能通過促進(jìn)CDK1、cyclin B1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期向G/M期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)有絲分裂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖，有望作為肝細(xì)胞肝癌臨床治療的新靶點(diǎn)。

目前，臨床缺乏有效的治療手段來治療肝細(xì)胞肝癌，尋找新的治療靶點(diǎn)、正確評估患者的病情，有助于延長患者的無病生存期。臨床根據(jù)腫瘤直徑、Edmondson分級、BCLC分期及門靜脈癌栓等評估病情嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，CDCA5、ERK的表達(dá)與Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、BCLC分期為B～C期、有門靜脈癌栓和AFP水平升高呈正相關(guān)（P＜0.05）。黃維甄等的研究顯示，病理分級、BCLC分期及門靜脈栓情況與肝細(xì)胞肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，病理分級為Ⅲ～Ⅳ級或BCLC分期為B～C期、合并門靜脈癌栓或AFP水平升高患者的生存期明顯縮短、生存率明顯下降，與本研究結(jié)果一致。表明CDCA5的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者的病情發(fā)展相關(guān)，可以反映其病情嚴(yán)重程度，臨床可根據(jù)CDCA5的相對表達(dá)量來評估疾病惡性程度，調(diào)整治療方案，可提高患者的預(yù)后。

綜上所述，CDCA5和ERK在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)與Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、BCLC分期為B～C期、有門靜脈癌栓和AFP水平升高呈正相關(guān)，CDCA5可能依賴ERK的磷酸化來促進(jìn)CDK1、cyclin B1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期向G/M期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖。但CDCA5和ERK作用于肝細(xì)胞肝癌的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。但本研究納入的樣本量較少，可能會對結(jié)果產(chǎn)生一定誤差，但本研究為臨床肝細(xì)胞肝癌的治療提供了新的思路。