右美托咪定調控miR-126對高糖誘導的心肌細胞氧化應激及凋亡的影響

孔建強 邴淼 汪瓊 汪建勝

(上海市寶山區中西醫結合醫院麻醉科, 上海 寶山 201999)

糖尿病是臨床常見的疾病之一，其中大部分患者均伴有心血管疾病，而氧化應激損傷在糖尿病所致的心血管疾病中發揮重要作用，因而減輕心肌細胞氧化應激損傷有助于提高糖尿病性心血管疾病的治療效果[1-2]。目前關于糖尿病性心血管疾病尚無理想治療藥物，因而尋找安全性高且毒性較小的藥物已然成為研究重點[3-4]。有研究[5]表明右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)可抑制燙傷大鼠心肌細胞凋亡。但DEX在糖尿病性心血管疾病中的治療效果及作用機制尚未完全闡明。孟佩盈等[6]研究顯示微小RNA-126(microRNA-126，miR-126)在2型糖尿病伴冠心病患者中呈低表達，其表達量與冠狀動脈病變嚴重程度密切相關。因此，本研究采用高糖處理心肌細胞，探討DEX對心肌細胞氧化應激及凋亡的影響，分析其對miR-126的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細胞H9C2購自美國ATCC公司，DEX購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，葡萄糖購自山東祥瑞藥業有限公司，杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自北京博邁斯科技發展有限公司，Trizol試劑購自北京全式金生物技術有限公司，反轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，miR-126寡核苷酸模擬物(miR-126 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-126特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-126)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司，RIPA裂解液購自上海士鋒生物科技有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3的前體蛋白(pro-caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cl-caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 取對數期心肌細胞接種于6孔板中，分別用葡萄糖濃度為5.5、35 mmol/L的DMEM培養基培養，分別記為對照組、高糖損傷模型組。分別使用不同濃度(5、10、20 μg/L )DEX處理心肌細胞，置于含有葡萄糖濃度為35 mmol/L的DMEM培養基培養24 h，分別記作實驗1組、實驗2組、實驗3組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-126 mimics轉染至心肌細胞，使用含有葡萄糖濃度為35 mmol/L的DMEM培養基培養24 h，分別記為miR-NC組、miR-126組。參照Lipofectamine 2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-126 mimcis、anti-miR-NC、anti-miR-126轉染至心肌細胞，使用含有葡萄糖濃度為35 mmol/L與DEX濃度為20 μg/L的 DMEM培養基培養24 h，分別記作實驗3+miR-NC組、實驗3+miR-126組、實驗3+anti-miR-NC組、實驗3+anti-miR-126組。

1.2.2 檢測LDH、MDA、SOD的含量 取對數期心肌細胞(3×104個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)，按照“1.2.1”實驗分組處理后，收集細胞，按照試劑盒說明書檢測LDH、MDA、SOD的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組對數期心肌細胞，預冷PBS洗滌，4 ℃條件下經1000 r/min離心10 min，加入500 μL結合緩沖液，依次加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，充分混勻，室溫振蕩搖晃孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀及Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-126的表達水平 收集各組對數期心肌細胞，采用Trizol法提取細胞中的總RNA。應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280處于1.8～2.0。參照反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，miR-126正向引物5′-GGCTTCGTACCG TGAGTAAT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGA GGT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATA TACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTA TTC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環。miR-126以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-126相對表達量。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測pro-caspase-3、cl-caspase-3蛋白水平 收集各組對數期心肌細胞，加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液(pro-caspase-3稀釋比1:1000、cl-caspase-3稀釋比1∶1000，內參GAPDH1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，暗室內曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 右美托咪定對高糖誘導心肌細胞氧化應激的影響 與對照組比較，高糖損傷模型組LDH、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD含量顯著降低(P<0.05)；與高糖損傷模型組比較，實驗1組、實驗2組、實驗3組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)，實驗1組、實驗2組、實驗3組間LDH、MDA、SOD的含量比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 LDH、MDA、SOD的含量

2.2 右美托咪定對高糖誘導心肌細胞凋亡及miR-126表達的影響 與對照組比較，高糖損傷模型組miR-126的表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與高糖損傷模型組比較，實驗1組、實驗2組、實驗3組miR-126的表達水平升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，實驗1組、實驗2組、實驗3組間各指標比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 右美托咪定對高糖誘導心肌細胞凋亡的影響

圖1 右美托咪定對高糖誘導心肌細胞凋亡及蛋白表達的影響

2.3 過表達miR-126對高糖誘導心肌細胞氧化應激和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-126組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 miR-126對高糖誘導心肌細胞凋亡及蛋白表達的影響

表3 miR-126對高糖誘導心肌細胞氧化應激和凋亡的影響

2.4 miR-126對右美托咪定作用的高糖誘導心肌細胞氧化應激、凋亡的影響 與實驗3+miR-NC組比較，實驗3+miR-126組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與實驗3+anti-miR-NC組比較，實驗3+anti-miR-126組LDH、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD含量顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 miR-126對右美托咪定作用的高糖誘導心肌細胞凋亡及蛋白表達的影響

表4 miR-126對右美托咪定作用的高糖誘導心肌細胞氧化應激、凋亡的影響

3 討論

糖尿病患者體內持續的高血糖水平可增加心血管疾病的發生風險，高血糖可通過氧化應激及誘導細胞凋亡從而對心肌組織造成損傷。既往研究[7-8]顯示miRNA在高糖誘導的心肌細胞中表達異常并可能參與心肌細胞損傷過程。目前關于糖尿病性心血管疾病的治療藥物成為重點研究，因此本研究積極探尋新型治療藥物并分析其可能作用機制。

DEX可抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥反應從而減輕心肌損傷[9]。有研究[10]表明DEX可通過抑制心肌細胞凋亡從而改善大鼠心肌缺血-再灌注損傷后的心室功能。另有相關報道[11]指出DEX可抑制抗鏈尿佐菌素誘導的糖尿病大鼠心肌氧化應激及細胞凋亡。氧化應激指標主要包括LDH、MDA、SOD，心肌細胞氧化損傷時LDH含量增加，SOD屬于抗氧化酶類，并可通過協調氧化與抗氧化平衡從而保護心肌細胞免受氧化應激損傷，MDA屬于氧化酶類并可作為脂質過氧化的標志物，還可反應細胞氧自由基損傷的嚴重程度[12-17]。本研究結果顯示高糖處理后心肌細胞中LDH、MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低，不同濃度的DEX處理后LDH、MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高，提示DEX可減輕高糖誘導的心肌細胞氧化損傷，且呈劑量依賴效應。

細胞接受凋亡信號時，caspase級聯反應被激活后可促進caspase-3活化形成cl-caspase-3，cl-caspase-3表達上調可促進細胞凋亡，而pro-caspase-3表達上調可抑制細胞凋亡[8-19]。本研究結果顯示高糖處理后心肌細胞凋亡率顯著升高，cl-caspase-3表達上調，pro-caspase-3表達下調，而不同濃度的DEX處理后心肌細胞凋亡率顯著減低，cl-caspase-3表達下調，pro-caspase-3表達上調，提示DEX可能通過調控細胞凋亡相關蛋白表達從而抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡。

研究[20]表明miR-126可抑制急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡。miR-126表達量降低與心肌缺血再灌注損傷發生密切相關[21]。本研究結果顯示高糖處理后心肌細胞中miR-126的表達下調，DEX處理后可明顯促進miR-126的表達，且呈劑量依賴效應，進一步研究顯示miR-126過表達后LDH、MDA含量降低，SOD含量升高，細胞凋亡率降低，cl-caspase-3表達下調，pro-caspase-3表達上調，提示miR-126過表達可增強高糖誘導的心肌細胞抗氧化能力并抑制心肌細胞凋亡。為探究DEX是否通過調控miR-126的表達從而影響高糖誘導心肌細胞氧化應激、凋亡。本研究分別將miR-126 mimics、anti-miR-126轉染至心肌細胞，使用DEX與高糖共同處理，結果顯示miR-126過表達能增強DEX對高糖誘導心肌細胞氧化應激、凋亡的作用，抑制miR-126表達能減弱DEX對高糖誘導心肌細胞氧化應激、凋亡的作用，提示DEX可能通過上調miR-126表達從而抑制高糖誘導心肌細胞氧化應激及細胞凋亡。但本研究仍需通過體內實驗驗證DEX對心肌細胞氧化應激損傷及細胞凋亡的作用及分子機制。

4 結論

本研究結果顯示，DEX可通過調控miR-126表達保護心肌細胞免受高糖誘導的氧化應激損傷，可為糖尿病性心血管疾病的治療提供了新方向。