淺談諾如病毒核酸檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)

陳慧毅 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心 （北京 100081）

內(nèi)容提要：諾如病毒導(dǎo)致的兒童和成年人急性胃腸炎經(jīng)常出現(xiàn)聚集發(fā)病，已經(jīng)成為比較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。近幾年諾如病毒核酸檢測(cè)試劑申報(bào)企業(yè)數(shù)量也在逐年上升，為提高此類產(chǎn)品的質(zhì)量和方便監(jiān)管人員的審評(píng)尺度，文章介紹了諾如病毒核酸檢測(cè)試劑的性能要求和研發(fā)過(guò)程中可能需要關(guān)注的問(wèn)題。

諾如病毒（Norovirus，NV）是導(dǎo)致兒童和成年人急性胃腸炎的主要病原體，臨床表現(xiàn)以起病急，傳播快，嘔吐等為主要特征[1]。諾如病毒感染在冬季呈季節(jié)性高發(fā)[2]。諾如病毒為單股正鏈無(wú)包膜的RNA病毒，屬于杯狀病毒科，包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。ORF1編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制過(guò)程；ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白（VP1）；ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白（VP2）[3]。諾如病毒分7個(gè)基因組（GⅠ-GⅦ）和40多個(gè)基因亞型，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，我國(guó)目前最常見(jiàn)的諾如病毒為GⅠ，GⅡ，其中諾如病毒GⅡ占到86.9%[3,4]。為提高此類產(chǎn)品的質(zhì)量和方便監(jiān)管人員的審評(píng)尺度，本文介紹了諾如病毒核酸檢測(cè)試劑的性能要求和研發(fā)過(guò)程中可能需要關(guān)注的問(wèn)題。

1.預(yù)期用途

產(chǎn)品的預(yù)期用途決定了產(chǎn)品的定位，明確了產(chǎn)品未來(lái)的使用場(chǎng)景，不僅需要說(shuō)明檢測(cè)指標(biāo)的臨床意義，更加限定了使用人群。建議申請(qǐng)人在說(shuō)明書(shū)的預(yù)期用途部分明確樣本類型和檢測(cè)的基因型別等信息。不同樣本類型和基因型別需要在分析性能研究中分別驗(yàn)證。

2.企業(yè)參考品、質(zhì)控品和內(nèi)對(duì)照的設(shè)置

企業(yè)參考品是考察產(chǎn)品性能的重要工具。一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、精密度參考品等。陽(yáng)性參考品是評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度的重要指標(biāo)，設(shè)置需要覆蓋能夠檢出的基因型別，保證產(chǎn)品不漏檢。陰性參考品重點(diǎn)考察產(chǎn)品的特異性，一般需要設(shè)置常見(jiàn)的腸道病原體以及容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的病原體。精密度參考品建議包括產(chǎn)品能夠檢出的基因型別和不同濃度梯度，其中包括檢測(cè)限附近的濃度。由于諾如病毒比較容易獲取，且人工構(gòu)建的質(zhì)粒和真實(shí)病毒差異較大，不能完全反映檢測(cè)試劑的性能，所以企業(yè)參考品不建議使用質(zhì)粒。

試劑盒的質(zhì)量控制體系一般包括陰陽(yáng)質(zhì)控品、內(nèi)對(duì)照等。陰陽(yáng)質(zhì)控品應(yīng)參與樣本處理以及核酸的提取環(huán)節(jié)，等同于樣本參與操作的全過(guò)程。內(nèi)對(duì)照可對(duì)試驗(yàn)過(guò)程可能存在的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、儀器、試劑和操作等所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制（內(nèi)對(duì)照既要保證其熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶核酸序列檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性）。只有設(shè)置全面的質(zhì)量控制體系才能保證檢測(cè)過(guò)程的完整，有利于檢測(cè)結(jié)果的分析。

3.分析性能

3.1 核酸提取效率的評(píng)價(jià)

核酸提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物等，這些都是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。需要申請(qǐng)人提交核酸提取效率的評(píng)價(jià)資料，并且在說(shuō)明書(shū)中注明配套使用的核酸提取試劑或核酸提取儀型號(hào)，以方便使用者參考。

3.2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

可以采用已上市同類產(chǎn)品的方法學(xué)比較、檢測(cè)陰陽(yáng)性企業(yè)參考品等方法。其中陽(yáng)性樣本或陽(yáng)性企業(yè)參考品的檢測(cè)旨在評(píng)價(jià)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的各種主要型別是否能被檢出。陰性樣本或陰性企業(yè)參考品旨在評(píng)價(jià)試劑特異性。

3.3 包容性的評(píng)價(jià)

由于病毒容易出現(xiàn)變異，不同時(shí)間、區(qū)域的病毒可能在基因序列存在差異，申報(bào)產(chǎn)品能否檢測(cè)出不同時(shí)間、區(qū)域的病毒株是能否滿足臨床檢測(cè)要求的重要指標(biāo)。包容性驗(yàn)證中建議使用臨床樣本，樣本濃度建議使用最低檢測(cè)限濃度附近。

3.4 最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)

最低檢測(cè)限能夠反映試劑的最低檢出能力，是評(píng)價(jià)試劑性能的重要指標(biāo)。

3.4.1 最低檢測(cè)限的建立

建議采用對(duì)已知濃度的樣本進(jìn)行系列稀釋后重復(fù)檢測(cè)的方法，確定申報(bào)試劑的最低檢測(cè)限。在上述重復(fù)檢測(cè)過(guò)程中，記錄不同稀釋度樣本檢出的結(jié)果。采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit模型）和分析方法，計(jì)算試劑在設(shè)定概率下的檢測(cè)限，一般選擇檢測(cè)濃度具有95%的陽(yáng)性檢出率。

建議通過(guò)另外制備最低檢測(cè)限濃度水平的病毒稀釋液對(duì)95%的檢出率進(jìn)行確認(rèn)。

3.4.2 最低檢測(cè)限的驗(yàn)證

申請(qǐng)人應(yīng)在病毒最低檢測(cè)限或接近最低檢測(cè)限的濃度，對(duì)每種型別的病毒（病毒株或臨床樣本）進(jìn)行驗(yàn)證。

每種病毒型別分別建立和驗(yàn)證最低檢測(cè)限。

3.5 精密度評(píng)價(jià)

精密度包括重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性，一般建議申請(qǐng)人對(duì)試劑精密度進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。申請(qǐng)人進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)應(yīng)主要關(guān)注以下幾點(diǎn)。

首先，需要對(duì)影響精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，包括操作者、時(shí)間、地點(diǎn)、測(cè)量?jī)x器、測(cè)量程序、試劑批次、檢測(cè)輪次等，精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。

其次，設(shè)定合理的評(píng)價(jià)周期，一般建議進(jìn)行為期20d檢測(cè)。

再次，建議使用臨床樣本或病毒株進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，并至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、中或強(qiáng)陽(yáng)性樣本。①陰性樣本：待測(cè)物濃度低于最低檢測(cè)限或?yàn)榱銤舛龋幮詸z出率為100%（n≥20）。②臨界陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度略高于最低檢測(cè)限水平，陽(yáng)性檢出率為100%（n≥20）。③中或強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

3.6 特異性

3.6.1 交叉反應(yīng)

用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣微生物、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體、感染部位的定植菌等。如：輪狀病毒、腸道腺病毒、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌屬、志賀菌屬、臨床常見(jiàn)厭氧菌等。

建議選擇高濃度水平的交叉反應(yīng)物進(jìn)行驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高。

申請(qǐng)人應(yīng)提供所有病原體的詳細(xì)資料，包括病原體的來(lái)源、確認(rèn)方法、濃度檢測(cè)方法等。

3.6.2 干擾物質(zhì)

建議申請(qǐng)人根據(jù)所采集的樣本類型，針對(duì)可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并在諾如病毒臨界陽(yáng)性水平進(jìn)行檢測(cè)。潛在干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括：血紅蛋白、白細(xì)胞、黏蛋白、糞便中未消化的食物纖維、臨床常用藥物干擾等。

4.陽(yáng)性判斷值

陽(yáng)性判斷值確定資料主要指對(duì)申報(bào)產(chǎn)品核酸檢測(cè)的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進(jìn)行確認(rèn)的資料。陽(yáng)性判斷值研究資料樣本來(lái)源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來(lái)源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲線的方式確定申報(bào)試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)的文件。如采用其他方法對(duì)陽(yáng)性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說(shuō)明這種方法的合理性，提供內(nèi)對(duì)照值的確定方法和研究資料。閾值設(shè)置應(yīng)科學(xué)合理。

另外，建議通過(guò)臨床評(píng)價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)陽(yáng)性判斷值的準(zhǔn)確性。

5.討論

諾如病毒通過(guò)以糞口途徑傳播為主，患者的嘔吐物、排泄物形成的氣溶膠，極易造成環(huán)境污染，導(dǎo)致聚集性病例，可能引起重癥和死亡，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[5,6]。及時(shí)的尋找致病病原體和切斷傳播途徑，是防止疾病大面積擴(kuò)散的有效手段。

本文簡(jiǎn)單介紹了此類產(chǎn)品上市前的性能要求，包括設(shè)定合理的預(yù)期用途、制備完善的企業(yè)參考品、充分合理的分析性能驗(yàn)證、正確的陽(yáng)性判斷值等。產(chǎn)品的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)驗(yàn)證是一個(gè)系統(tǒng)工程，前期還需要對(duì)原材料進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選驗(yàn)證，制定嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)還需要對(duì)產(chǎn)品涉及的各種生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究確認(rèn)。上市前還需要研究產(chǎn)品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，開(kāi)封穩(wěn)定性，運(yùn)輸穩(wěn)定性等。最后還需要提供臨床評(píng)價(jià)資料證明產(chǎn)品的臨床有效性。諾如病毒是一種RNA病毒，隨著時(shí)間容易發(fā)生變異和重組，重組型諾如病毒的RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）區(qū)和VP1區(qū)差異會(huì)導(dǎo)致不同基因亞型[7]。產(chǎn)品設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)過(guò)程中需要重點(diǎn)關(guān)注設(shè)計(jì)的引物探針序列是否在保守區(qū)域，能否檢出突變株。同時(shí)，考慮到我國(guó)區(qū)域遼闊，建議申請(qǐng)人選擇不同時(shí)間、區(qū)域的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，保證臨床檢測(cè)中不漏檢。