雙重實時熒光定量PCR法檢測腹瀉中病毒的價值

樊永慧

近年來研究表明[1]，引起人類非細菌性胃腸炎的重要病原是諾如病毒，其引起嚴重的食品安全、公共衛生問題，據不完全統計[2]，≥95%急性病毒性胃腸炎暴發，是由諾如病毒導致的，傳染性較高，傳播方式有：糞便-口途徑傳播、人-人之間直接傳播，嚴重影響世界公共衛生。經調查研究顯示[3]，腹瀉是臨床常見的消化內科疾病，是指：與平日習慣頻率比較，排便次數增加、糞質稀薄及水分增加等，排便量≥200 g/d，或者含有未消化食物、黏液及膿血等，患病后常有排便急迫感、肛門不適及失禁等癥狀表現，發病機制較復雜，可能與病毒、細菌及寄生蟲引起腸道感染等因素有關，其中引起感染的主要病毒是GⅠ型、GⅡ型諾如病毒，因此探尋經濟、有效及可行的檢測方法，逐漸成為醫學界研究熱點。張濛等[4-5]認為，采用雙重實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR，polymerase chain reaction）法能控制疾病進展、改善患者預后，具有操作簡便、快速及特異性強等優勢，臨床應用較廣泛，得到患者的青睞、認可，基于上述背景，本研究分析腹瀉患者糞便中諾如病毒（GⅠ+GⅡ）行雙重實時熒光定量PCR法檢測的價值，報道如下。

1 資料和方法

1.1 基線資料

研究2019年1月—2020年3月我市人民醫院送檢的腹瀉患者的糞便標本共400份，其中男性有210例，女性有190例，年齡41～68歲，均值（52.39±6.42）歲；體質量19～26 kg/m2，均值是（23.29±5.47）kg/m2。（1）采集糞便的標準：腹瀉病程≥2周；排便次數≥3次/日，糞便呈稀便、水樣便、膿血便及黏液便等；患者表現為不同程度排便次數增加、腹痛等不適癥狀[6]；體征平穩、意識清晰；患者知情并簽署“知情同意書”；醫院倫理委員會審核同意。（2）排除標準：心肝腎功能障礙者；細菌性感染后的腹瀉糞便標本；伴惡性腫瘤者；認知、精神障礙者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 糞便采集 采集患者糞便標本5～10 g，未加入任何培養基、試劑，等待30 min后凍存于零下20℃的冰箱，盡量≤1個月內完成檢測。采用0℃冰壺運送標本，陽性糞便標本：經江蘇省句容市疾病預防控制中心復核后，確認為諾如病毒GⅠ和GⅡ陽性的糞便樣本，采用PBS稀釋為10%病毒懸濁液，冷存于零下80℃等待檢測[7]。

1.2.2 儀器及試劑 涉及儀器有：高速臺式冷凍離心機（德國Sigma，2～16K）、熒光定量AB7500 PCR儀（美國ThermoFisher分析儀器股份公司）、病毒核酸提取試劑盒及PCR檢測試劑盒。

1.2.3 提取RNA病毒 利用病毒核酸提取試劑盒+快速柱式提取法，提取糞便標本的病毒核酸，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 雙重實時熒光定量PCR法 涉及試劑有：諾如病毒（GⅠ+GⅡ））雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒（上海之江公司），PCR反應按照試劑盒說明書操作，總體積是20 μl，劃分為 18 μl熒光反應液、1 μl酶混合物和 1 μl內部對照，將樣品RNA處理后，熒光反應利用熒光定量PCR儀進行。（1）條件：溫度45℃、持續10 min、反轉錄，進行1個循環；（2）預變性：溫度為94℃、持續2 min、進行1個循環；（3）PCR擴增：溫度為94℃、持續15 s、進行40個循環，60℃延伸時，對熒光信號進行收集；（4）報告基團：具體設置成FAM、VIC，其中GⅠ型諾如病毒采用FAM基團監測，GⅡ型諾如病毒采用VIC基團監測[8-9]。

1.3 觀察指標

（1）試驗有效性：①試驗有效：陰性對照的FAM、VIC通道均為陰性；②陽性對照的FAM、VIC通道均呈擴增。

（2）FAM通道：Ct值＜38，GⅠ型諾如病毒核酸呈陽性，Ct值若顯示為無，則表示樣本呈陰性，說明GⅠ型諾如病毒核酸呈陰性，Ct值處于38～40時，表示再次進行試驗，重復擴增曲線呈擴增，表示GⅠ型諾如病毒呈陽性，反之呈陰性。

（3）VIC通道：Ct值＜38，GⅡ型諾如病毒核酸呈陽性，Ct值若顯示為無，則表示樣本呈陰性，說明GⅡ型諾如病毒核酸呈陰性，Ct值處于38～40時，表示再次進行試驗，重復擴增曲線呈擴增，表示GⅡ型諾如病毒呈陽性，反之表示樣本呈陰性[10]。

2 結果

本研究選擇400份腹瀉患者的糞便標本，實行雙重實時熒光定量PCR法檢測發現，GⅠ型諾如病毒感染有15例，檢出率是3.75%；GⅡ型諾如病毒感染有59例，檢出率是14.75%；GⅠ型、GⅡ型諾如病毒混合感染有6例，檢出率是1.50%，諾如病毒的總檢出率是20.00%。

3 討論

腹瀉是臨床常見癥狀，俗稱為“拉肚子”，常因細菌性痢疾、敗潰瘍性結腸炎、血吸蟲病、病毒性腸炎及麥角性腸病等疾病引起的，具有起病急、遷延難愈及反復發作等特點，發病時常有排便急迫感、肛門失禁及肛門不適等癥狀表現，未及時治療影響患者預后效果、甚至危及生命，因此早期合理的檢測方法，受到臨床高度重視。近年來研究表明[11-12]，諾如病毒是引起腹瀉的重要原因，傳播途徑有：食物、水源及人群接觸等，是誘導急性病毒性胃腸炎、食源性疾病暴發的重要原因，具體分析如下：（1）急性病毒性胃腸炎其屬于自限性疾病，患病后患者常有惡心嘔吐、腹瀉等癥狀表現，一般情況下呈膿血、水樣便等，一年四季均可能發病，其中秋冬季較多見，發病率較高，極易被誤診，若患者多次、大量腹瀉，引起嚴重脫水、電解質紊亂，部分群體產生休克、昏迷及心跳停止等，甚至危及生命；（2）食源性疾病常見疾病類型是食物中毒，是指：食用生物性、化學性有害物質污染的視頻，出現急性、亞急性食源性疾病，在氣溫較高的夏秋季發病率就較高，具體劃分成：細菌性食物中毒、非細菌性食物中毒，具有發病率高、遷延難愈等特點，患病后患者常表現為惡心嘔吐、腹瀉及腹痛等胃腸炎癥狀，未及時治療引起脫水、酸中毒及休克等，甚至危及生命，因此王強等[13]認為，選擇操作簡便、特異性較強、重復性良好及時效性強等優勢的檢測方法迫在眉睫。

有研究報道[14]，雙重實時熒光定量PCR法檢測GⅠ型、GⅡ型諾如病毒具有較高的時效性，其中GⅠ型諾如病毒特異性采用Taqman探針的5’端標記為FAM，GⅡ型諾如病毒特異性采用Taqman探針的5’端標記為VIC，將相關標本放置于同一反應管，同期開展標本檢測、分型，確保數小時內獲得諾如病毒的病原體型別、縮短檢測時間，將錯綜復雜的檢測步驟簡化，提高諾如病毒檢測效率，具備較高的臨床應用價值。

經調查研究顯示，檢測諾如病毒是疾病監測體系的重要組成部分，回顧分析患者既往飲食調查史，結合病毒病原體檢測數據、網絡上報體系，實施追溯疾病誘因、傳染源，及時發現并控制病毒引起的疾病暴發，有效治療、預防并控制諾如病毒引起的疾病，改善患者預后效果、穩定病情。

本研究示：選擇400份腹瀉患者的糞便標本，實行雙重實時熒光定量PCR法檢測發現，GⅠ型諾如病毒感染有15例，檢出率是3.75%；GⅡ型諾如病毒感染有59例，檢出率是14.75%；GⅠ型、GⅡ型諾如病毒混合感染有6例，檢出率是1.50%，諾如病毒總檢出率是20.00%，與陸蕓等[15-16]文獻結果接近。

綜上所述，腹瀉患者的糞便采用雙重實時熒光定量PCR法檢測具有較高的臨床應用價值，為后期治療提供可靠性保障、改善預后效果。