UPLC-MS/MS法測定水稻中噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的殘留及膳食風險評估

陳國峰 尤紅梅 滕瑤 劉峰 張曉波 董見南 廖輝

（黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所，哈爾濱 150086；第一作者：hljjiance@163.com；*通訊作者：nkliaohui@vip.163.com）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一。2018年我國水稻種植面積約為0.3億hm2，稻谷產量約為2.1億t[1-3]。同時中國一直是世界上最大的大米消費國家[4-5]。然而水稻病蟲草害頻發，使水稻產量遭受了嚴重的損失。近年來，隨著雜草的抗藥性逐漸增加，其危害導致水稻產量減少甚至絕收[6-7]。目前我國登記的防治水稻一年生雜草的農藥有2 100余種，其中噁唑酰草胺和氰氟草酯的復配農藥對移栽和直播水稻的一年生雜草有良好防效[8-9]。

噁唑酰草胺是由韓國化工技術研究院開發的高效低毒的芳氧苯氧丙酸酯類（advanced oxidation protein products,AOPPs）除草劑，對一年生禾本科雜草有很好的防治效果[10-12]。噁唑酰草胺在環境中主要有3個代謝產物,分別為HFMPA、HPFMPA和6-CBO。氰氟草酯是由美國陶氏益農公司開發的高效、內吸性的芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，能夠有效防除多種一年生禾本科雜草，對稗草和千金子尤為有效。氰氟草酯在環境中會產生一系列的降解產物，其中氰氟草酸和氰氟草二酸是具有毒理學意義的代謝產物[13-15]。將噁唑酰草胺和氰氟草酯兩者混配使用，可以提高對水稻田一年生禾本科雜草的殺草譜及防效，以及增加對抗性雜草的防效。目前我國規定，糙米中噁唑酰草胺的最大殘留限量MRL為0.05 mg/kg、氰氟草酯（氰氟草酯及氰氟草酸之和）的MRL為0.10 mg/kg（GB 2763）。

關于噁唑酰草胺在水稻中的殘留分析及環境行為，以及氰氟草酯的抗性、藥效以及殘留等方面的研究已有大量報道[16-17]。但同時測定糙米、稻殼、秸稈中噁唑酰草胺、氰氟草酯及其代謝產物殘留量卻沒有相關報道。此外，很少有研究評估大田條件下使用噁唑酰草胺和氰氟草酯后的膳食風險。本研究的目的是：（1）建立一種簡單，快速，有效的分析方法，通過UPLC-MS/MS法同時測定糙米、稻殼、秸稈中噁唑酰草胺、氰氟草酯及其代謝產物的殘留量；（2）研究田間施用20%噁唑酰草胺·氰氟草酯乳油在糙米中的最終殘留；（3）評估噁唑酰草胺和氰氟草酯在膳食中的攝入風險。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

噁唑酰草胺（純度98.8%）、氰氟草酸（83.0%）由Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供。HPFMPA（99.2%）、HFMPA（99.6%）和6-CBO（99.2%）均由富美實(上海)化學技術有限公司提供。氰氟草酯（98.0%）購買自上海市農藥研究所有限公司。氰氟草二酸（99.2%）則由林純藥工業株式會社提供。色譜純乙腈、甲酸均購自北京迪馬歐泰科技發展中心（中國）。分析純的乙腈和氯化鈉購自北京益利精細化學品有限公司（中國北京）。石墨化碳黑（GCB）、N-（正丙基）乙二胺（PSA）和C18均購自艾杰爾公司（中國天津）。有機系濾膜（尼龍，0.22 μm）購自北京迪馬歐泰科技發展中心（中國）。

表1 試驗地氣候條件及土壤類型

X-TQS三重四級桿質譜，配有電噴霧離子源（ESI），美國Waters公司生產；BT 2202 S電子天平，德國賽多利公司生產；CF15RX高速離心機，日本日立公司生產；HS501振蕩器，德國IKA公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗

按照《農產品中農藥殘留試驗準則》和《農藥登記殘留試驗區域指南》，2018年分別于我國水稻主產區的12地進行消解動態和最終殘留試驗。試驗地的氣候條件及土壤類型見表1。各地的最終殘留試驗設2個試驗小區，1個處理小區和1個對照小區，每個小區面積100 m2。小區之間設保護行。水稻2葉1心期以225 g/hm2a.i（制劑量：75 g/667 m2）施藥1次，于水稻成熟期收獲。

1.2.2 樣品制備

從每個試驗區以不同的間隔隨機收集稻穗2.0 kg和水稻秸稈樣品2.0 kg。將田間所采集的稻穗樣品脫粒、稻粒脫殼成糙米和稻殼，水稻秸稈樣品剪切成1 cm以下的小段，充分混勻，用四分法縮分樣品，分取2份200 g樣品，低溫（-18℃）保存。試驗前用磨粉機將糙米、稻殼和秸稈樣品制成粉末狀。

1.2.3 標準曲線配制

噁唑酰草胺、HPFMPA、HFMPA和6-CBO以及氰氟草酯、氰氟草酸、氰氟草二酸的標樣溶液配制：分別稱取10 mg標準品至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至10 mL，濃度為1 000 mg/L。將上述7種化合物的工作液用乙腈稀釋配得100 mg/L的標準混合液，保存在4℃下直至使用。

1.2.4 樣品前處理

分別稱取糙米10.0 g、稻殼2.0 g和秸稈2.0 g樣品于50 mL離心管中，依次加入10 mL去離子水和20 mL乙腈，振蕩30 min，加入3 g NaCl，渦旋10 min，以10 000 r/min的速度離心10 min，待凈化。將1 mL上層乙腈相轉移至稱有50 mg PSA的離心管中，渦旋30 s，10 000 r/min離心3 min，取上清液經0.22 μm有機系濾膜過濾，待測。

1.2.5 儀器條件

配備有超高效液相色譜（I-Class，Waters）的三重四極桿串聯質譜儀（UPLC-MS/MS；Agilent）分析噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝產物。配T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）用于液相色譜分離，柱溫為30℃，進樣體積為2 μL，流速0.3 mL/min。流動相由0.2%的甲酸在水（A）和乙腈（B）的混合溶劑組成。分離通過梯度洗脫，洗脫程序：0～1 min，10% B；1～2.0 min，10%～90% B；2.0～3.0 min，90% B；3.0～3.5 min，90%～10% B；3.5～5.0 min，10% B。離子源：電噴霧離子源ESI和APCI源；掃描方式：正離子掃描；毛細管電壓：3.5 KV；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；檢測方式：多重反應監測（MRM）。具體質譜參數見表2。

1.2.6 定量限（LOQ）和檢測限（LOD）

以3倍的信噪比（S/N）來確定目標化合物的LOD，以最小添加回收濃度作為方法的定量限（LOQ）。為了確定LOD，將混合的標準工作溶液（1.0 mL）在旋轉蒸發儀中干燥，然后用糙米、稻殼和秸稈基質重新溶解并稀釋，直到每種目標化合物的S/N為3。為了確定糙米、稻殼和秸稈中的噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝產物的LOQ，將一系列糙米、稻殼和秸稈樣品加標最低濃度（0.01 mg/L）的工作溶液，按照上述的方法進行提取和凈化，逐級稀釋直至目標化合物的S/N為10。

表2 噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的質譜參數

1.2.7 添加回收測定

將混有噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝產物的標準溶液分別添加3組濃度到空白糙米、稻殼和秸稈樣品中，每檔濃度重復5次，用上述分析方法測定并計算相對標準偏差。

1.3 數據處理

全國評估的噁唑酰草胺和氰氟草酯的每日攝入量（NEDI，mg）和風險商（RQ）計算公式如下：NEDI=∑（STMRi×Fi）；RQ=NEDI/ADI×bw×100%。

其中，STMRi（mg/kg）是在中國規定的水稻或其他農作物中的噁唑酰草胺和氰氟草酯的殘留中值。如果沒有相關的STMRi則將相應的最大殘留限量（MRL）用于計算NEDI。Fi（kg）是中國某種食物的平均每日攝入量。每日允許攝入量（mg/kg bw）是可接受的每日攝入量（ADI）的噁唑酰草胺和氰氟草酯。bw是中國成年人的平均體質量（63 kg）。RQ通過比較NEDI和ADI值確定，通常在GAP下確定。RQ值越高，農藥殘留量越高；RQ＞100%表示被評估的食品對消費者的健康風險高到令人無法接受的程度[18]。

2 結果與分析

2.1 提取與凈化

圖1 優化噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝產物提取溶劑

本研究對噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的提取溶劑甲醇、50%乙腈水、純乙腈進行了優化。用混合標準溶液加標糙米，以使上述3種介質中噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的含量均為0.1 mg/kg。如圖1所示，使用甲醇對噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的提取率在54.3%～87.2%之間，使用50%乙腈水的提取率在94.3%～98.2%之間，使用乙腈的提取率在80.6%～95.4%之間。可見，50%乙腈水是提取糙米中噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的最佳溶劑。

據我們所知，最常用的分散固相萃取材料是PSA、GCB、C18[19]。PSA主要用于去除某些極性雜質，例如有機酸、脂肪酸和糖類；C18用于去除非極性物質，例如脂質和色素；而GCB主要用于有效去除基質中的色素并吸收特定的農藥[20-21]。根據各分散固相萃取材料相對成本和性能，選擇PSA、GCB和C18進行此項研究。在糙米樣品（10.0 g）中加入混合標準溶液，使噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的濃度均為0.1 mg/kg，并用40 mL 50%乙腈水提取目標化合物，加NaCl鹽析后取上層乙腈提取液1 mL評估每種吸附劑的使用量。從表3可見，每1 mL提取物中的C18含量在25～100 mg時，噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的回收率低于87.4%；每1 mL提取物中的PSA含量為25～50 mg時，回收率介于82.3%～99.7%之間，當PSA含量超過50 mg時，回收率下降。當每1 mL提取物中用25～100 mg GCB提取時，噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的回收率為24.35%～72.6%，表明GCB與目標化合物之間具有強吸附性。考慮到樣品回收率和凈化的成本，建議使用50 mg PSA凈化糙米、稻殼和秸稈樣品中的雜質。

表3 提取溶液中凈化劑PSA、C18和GCB的優化

表4 噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的標準曲線和LOD

2.2 方法驗證

通過噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物標準溶液濃度與定量離子峰面積作標準曲線，表4中顯示了乙腈中噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的回歸分析結果，相關系數（R）均高于0.9991，這表明噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物在0.005～0.200 mg/L范圍內線性良好。

在上述條件下，噁唑酰草胺的最低檢出量為1.3×10-4ng，HPFMPA的最低檢出量為1.6×10-6ng，HFMPA的最低檢出量為6.1×10-5ng，6-CBO的最低檢出量為1.8×10-6ng，氰氟草酯的最低檢出量為1.5×10-4ng，氰氟草酸的最低檢出量為4.3×10-5ng，氰氟草二酸的最低檢出量為1.2×10-4ng。以最小添加回收濃度作為方法的定量限，在上述色譜條件下噁唑酰草胺及其代謝物HFMPA、HPFMPA和6-CBO在糙米、稻殼和秸稈中的最低檢出濃度均為0.01 mg/kg，氰氟草酯在糙米、稻殼和秸稈中的最低檢出濃度為0.01 mg/kg，其代謝物氰氟草酸和氰氟草二酸在糙米中的最低檢出濃度均為0.02 mg/kg，在稻殼中的最低檢出濃度為0.05 mg/kg，而在秸稈中的最低檢出濃度則為0.10 mg/kg。

通過重復（n=5）測量3種不同分析物濃度下的回收率來評估該方法的準確性。糙米中噁唑酰草胺、氰氟草酯及其代謝物的平均回收率為78.6%～104.5%，相對標準偏差（RSD）分別為2.1%和14.5%；在稻殼中的回收率為86.5%～103.1%，RSD為5.2%～14.0%；秸稈中平均回收率為78.4%～103.1%，RSD為3.6%～11.7%（表5）。以上結果表明，該方法的精密度、重現性和靈敏度足以同時定量測定糙米、稻殼和秸稈中的噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物殘留。

2.3 糙米、稻谷和秸稈中噁唑酰草胺和氰氟草酯的最終殘留量及膳食暴露風險評估

為了評估糙米和稻谷和秸稈樣品中的總噁唑酰草胺和氰氟草酯，可按以下公式分別計算噁唑酰草胺和氰氟草酯濃度的總殘留量[22]：

在黑龍江省等12個省份的試驗田，于水稻2葉1心期噴施1次20%噁唑酰草胺·氰氟草酯乳油，施藥劑量225 g/hm2，并于成熟期收獲糙米、稻谷和秸稈，用上述方法測定噁唑酰草胺和氰氟草酯的最終殘留量。結果表明，糙米、稻谷和秸稈中的噁唑酰草胺的殘留量均＜0.04 mg/kg，低于我國規定的糙米中噁唑酰草胺的MRL（0.05 mg/kg）；氰氟草酯在糙米、稻谷和秸稈中均未檢出，低于糙米中氰氟草酯的MRL（0.1 mg/kg）（表6）。

根據上述殘留數據，通過將國家估計的每日噁唑酰草胺和氰氟草酯攝入量與ADI進行比較，對糙米食用進行飲食風險評估。噁唑酰草胺和氰氟草酯的ADIs分別為0.017和0.01 mg/kg bw。

由表7可見，糙米中噁唑酰草胺的總NEDI為0.0096 mg，RQ為0.87%；糙米中氰氟草酯的總NEDI為0.0120 mg，RQ為1.90%。RQ值低表明殘留農藥含量較低。以上結果表明，糙米中的噁唑酰草胺和氰氟草酯均不會構成潛在的健康風險。

表5 噁唑酰草胺和氰氟草酯及其代謝物的添加回收率

表6 稻谷、糙米和秸稈中噁唑酰草胺和氰氟草酯的最終殘留量

表7 糙米中噁唑酰草胺和氰氟草酯的膳食風險評估

3 結論

本文開發了一種簡單、靈敏、高效的方法，結合了改良的QuEChERS技術和UPLC-MS/MS檢測技術，可同時定量測定糙米、稻殼和秸稈中的噁唑酰草胺及其代謝物HFMPA、HPFMPA和6-CBO以及氰氟草酯及其代謝物氰氟草酸和氰氟草二酸的殘留量。該方法具有回收率高、準確性高和可重復性強等優點。所提出的方法適用于監測田間和市場上的糙米和稻谷中噁唑酰草胺和氰氟草酯的殘留量。在田間條件下，在施用20%噁唑酰草胺·氰氟草酯乳油后，水稻成熟期采收的稻谷和糙米中噁唑酰草胺和氰氟草酯的最終殘留均未檢出，低于國標的MRL。糙米中的噁唑酰草胺和氰氟草酯的膳食風險評估結果顯示，成熟期收獲的糙米RQ分別為0.87%和1.90%。這些數據表明，20%噁唑酰草胺·氰氟草酯乳油以225 g/hm2的劑量于水稻2葉1心期施用1次，不會對人體健康造成潛在的危害。